セルロース還元末端の定量分析

従来のセルロース基質の総還元末端の定量化の方法は、酵素触媒セルロースの糖質との関連性のために評価されています。たとえば、アクセス可能な還元末端の定量化は、エクスポーティングのための基質濃度の最も直接的な尺度である可能性が高く、エンドプレファーリングセロビオヒドロラーゼを減少させます。2つの比色アッセイ（ジニトロサリチル酸[DNS]およびビシンコニン酸[BCA]アッセイ）とこの用途については、放射性同位体アプローチ（NAB3H4標識）（NAB3H4標識）を評価しました。セルロース基質には、微結晶セルロース、細菌セルロース、ろ紙が含まれていました。ユニットマスセルロースあたりの減少端の推定値は、アッセイシステムに依存していることがわかりました（つまり、DNSとBCAアッセイは著しく異なる結果をもたらしました）。DNSベースの値は、BCAアッセイを使用して得られた値よりも数倍高く、折り畳み式は基質特異的でした。比較的軽度の条件下で冷たいまたは放射性標識試薬を使用して、セルロースのホウ酸ナトリウムの減少を使用して、表面の数を評価しました（溶媒にアクセス可能）減少した端を評価しました。結果は、従来のセルロース基質の減少端の30〜40％が溶媒にアクセスできないことを示しています。つまり、それらはセルロース構造の内部に埋葬されているため、酵素をエクササイズすることはできません。

Methods for the quantification of total and accessible reducing ends on traditional cellulose substrates have been evaluated because of their relevance to enzyme-catalyzed cellulose saccharificaion. For example, quantification of accessible reducing ends is likely to be the most direct measure of substrate concentration for the exo-acting, reducing end-preferring cellobiohydrolases. Two colorimetric assays (dinitrosalicylic acid [DNS] and bicinchoninic acid [BCA] assay ) and a radioisotope approach (NaB3H4 labeling) were evaluated for this application. Cellulose substrates included microcrystalline celluloses, bacterial celluloses, and filter paper. Estimates of the number of reducing ends per unit mass cellulose were found to be dependent on the assay system (i.e. the DNS and BCA assays gave strikingly different results). DNS-based values were several-fold higher than those obtained using the BCA assay, with fold-differences being substrate specific. Sodium borohydride reduction of celluloses, using cold or radiolabeled reagent under relatively mild conditions, was used to assess the number of surface (solvent-accessible) reducing ends. The results indicate that 30-40% of the reducing ends on traditional cellulose substrates are not solvent accessible; that is, they are buried in the interior of cellulose structures and thus not available to exo-acting enzymes.