インスリン受容体基質-1（IRS-1）におけるタンパク質キナーゼC-ZETA誘導リン酸化は、IRS-1のインスリン受容体との相互作用とチロシンリン酸化を減衰させます。

インスリン受容体基質-1 (IRS-1) は、インスリン活性化プロテインキナーゼ C (PKC)-ゼータの新規上流基質として最近同定されました。この相互作用は、高インスリン血症状態下でインスリンシグナル伝達を下方制御します。このフィードバック ループの分子機構を解明するために、我々は IRS-1 の PKC-zeta リン酸化部位を同定し、その生物学的重要性を調査しようとしました。組換え IRS-1 フラグメントを PKC-zeta とインキュベートすると、ラット IRS-1 の Ser(318) (ヒト IRS-1 では Ser(323)) が主要な in vitro リン酸化部位として同定されました (Ser(318 の変異によって確認))からアラニン)。細胞抽出物中の Ser(318) のリン酸化をモニタリングするために、リン酸化部位特異的ポリクローナル抗体を調製しました。生物学的重要性は、インスリン受容体 (BHK(IR)) を安定して発現するベビーハムスターの腎臓細胞で研究されました。ホスホSer(318)特異的抗体を使用して、インスリンがIRS-1のSer(318)のリン酸化を刺激し、これは少なくとも部分的にPKC-zetaによって媒介されることを観察しました。さらに、我々は、以前に記載された、インスリン受容体とIRS-1の相互作用のインスリン刺激によるPKCゼータ媒介阻害およびIRS-1のチロシンリン酸化の減少が、IRS-1 Ser(318)の変異によって無効になることを発見した。アラニンに。BHK(IR)細胞で得られたこれらの結果は、PKC-ゼータによるSer(318)のリン酸化が、IRS-1機能に対する長期の高インスリン血症の抑制効果に寄与している可能性があることを示唆しています。

Insulin receptor substrate-1 (IRS-1) was recently identified as a novel upstream substrate for the insulin-activated protein kinase C (PKC)-zeta. This interaction down-regulates insulin signal transduction under hyper-insulinemic conditions. To clarify the molecular mechanism of this feedback loop, we sought to identify the PKC-zeta phosphorylation sites of IRS-1 and to investigate their biological significance. Upon incubation of recombinant IRS-1 fragments with PKC-zeta, we identified Ser(318) of rat IRS-1 (Ser(323) in human IRS-1) as the major in vitro phosphorylation site (confirmed by mutation of Ser(318) to alanine). To monitor phosphorylation of Ser(318) in cellular extracts, we prepared a polyclonal phosphosite-specific antibody. The biological significance was studied in baby hamster kidney cells stably expressing the insulin receptor (BHK(IR)). Using the phospho-Ser(318)-specific antibody we observed that insulin stimulates phosphorylation of Ser(318) in IRS-1, which is mediated, at least partially, by PKC-zeta. Moreover, we found that the previously described insulin-stimulated, PKC-zeta-mediated inhibition of the interaction of IRS-1 with the insulin receptor and the reduced tyrosine phosphorylation of IRS-1 was abrogated by mutation of IRS-1 Ser(318) to alanine. These results, generated in BHK(IR) cells, suggest that phosphorylation of Ser(318) by PKC-zeta might contribute to the inhibitory effect of prolonged hyperinsulinemia on IRS-1 function.