Saccharomyces cerevisiaeフラップエンドヌクレアーゼ1はフラップ平衡を使用して、三重項の繰り返し安定性を維持する

フラップエンドヌクレアーゼ1（FEN1）は、真核生物の岡崎フラグメント成熟の中心成分です。Saccharomyces cerevisiae fen1（Rad27）の遺伝分析は、トリヌクレオチドの繰り返し（TNR）の拡大を防ぐ上で重要な役割を明らかにしています。人間では、そのような拡大は神経変性疾患に関連しています。in vitroでは、FEN1はエンドヌクレアーゼ活性を使用してDNAリガーゼIと競合することによりTNR拡大を阻害できます。ここでは、FEN1がTNR拡大を防ぐメカニズムをさらに定義するために、2つの酵母FEN1ヌクレアーゼ変異体、RAD27-G67SとRAD27-G240Dを使用しました。TNRの不安定性と脆弱性の両方を検出できる酵母人工染色体システムを使用して、G240DはG67S変異ではなくG240Dがin vivoでのCTGトラクトの膨張と脆弱性の両方を増加させることを示しています。in vitroでは、G240Dヌクレアーゼは、固定されていない非反復二重フラップを切断するのに熟練しています。ただし、非回復とCTGを含む平衡フラップの両方の切断が重度に障害を示します。対照的に、野生型FEN1とG67S変異体は、固定CTGフラップよりも平衡フラップでより効率的な切断を示します。変異株で観察されるTNR膨張の程度と染色体脆弱性の量は、in vitroでのフラップ切断の欠陥の重症度と相関しています。Fen1のフラップ平衡とユニークな追跡メカニズムがどのように協力してTNRフラップを除去し、繰り返し拡大を防ぐことができるかを説明するモデルを提示します。

Flap endonuclease 1 (FEN1) is a central component of Okazaki fragment maturation in eukaryotes. Genetic analysis of Saccharomyces cerevisiae FEN1 (RAD27) also reveals its important role in preventing trinucleotide repeat (TNR) expansion. In humans such expansion is associated with neurodegenerative diseases. In vitro, FEN1 can inhibit TNR expansion by employing its endonuclease activity to compete with DNA ligase I. Here we employed two yeast FEN1 nuclease mutants, rad27-G67S and rad27-G240D, to further define the mechanism by which FEN1 prevents TNR expansion. Using a yeast artificial chromosome system that can detect both TNR instability and fragility, we demonstrate that the G240D but not the G67S mutation increases both the expansion and fragility of a CTG tract in vivo. In vitro, the G240D nuclease is proficient in cleaving a fixed nonrepeat double flap; however, it exhibits severely impaired cleavage of both nonrepeat and CTG-containing equilibrating flaps. In contrast, wild-type FEN1 and the G67S mutant exhibit more efficient cleavage on an equilibrating flap than on a fixed CTG flap. The degree of TNR expansion and the amount of chromosome fragility observed in the mutant strains correlate with the severity of defective flap cleavage in vitro. We present a model to explain how flap equilibration and the unique tracking mechanism of FEN1 can collaborate to remove TNR flaps and prevent repeat expansion.