PTDINS（3,4,5）P3のin vivoの役割は、Knockin変異によって定義されたPDK1 pHドメインへの結合

ホモ接合性ノッキンES細胞を生成し、3-ホスホイノシチド依存性タンパク質キナーゼ-1（PDK1）を生成し、ホスファチジルイノシトール3,4,5-トリスリン酸を廃止するプレクストリン相同性（PH）ドメインの突然変異（PH）ドメイン（Ptdins（3、）4,5）p3）触媒活性に影響を与えることなく結合。ノックイン細胞では、プロテインキナーゼB（PKB）はIGF1によって活性化されませんでしたが、リボソームS6キナーゼ（RSK）は正常に活性化され、PTDINS（3,4,5）P3がPKBに必要であるが、RSK活性化ではないことを示しています。。興味深いことに、IGF1ではなくアミノ酸とRHEBはノックイン細胞でS6Kを活性化し、PTDIN（3,4,5）P3がRHEBのPKB媒介活性化を通じてS6Kを刺激するという考えを支持しています。PTDINS（3,4,5）P3結合または基質ドッキング「PIFポケット」のいずれかを使用するPDK1ノックイン細胞を使用して、プロテインキナーゼCアイソフォームのリン酸化と安定化を調節する際にこれらのドメインが果たす役割を確立しました。さらに、PHドメインまたはPIFポケットが破壊されたマウスPDK1ノックイン胚は、E10.5とE11.5の間で異なる表現型を示すように死亡しました。PDK1は細胞サイズの調節に役割を果たしていますが、pHドメインまたはPIFポケットノッキン胚に由来する細胞は通常のサイズでした。これらの実験は、PDK1調節ドメインの役割を確立し、タンパク質脂質およびタンパク質間相互作用の生理学的機能を調べるノックイン技術の力を示しています。

We generated homozygous knockin ES cells expressing a form of 3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1 (PDK1) with a mutation in its pleckstrin homology (PH) domain that abolishes phosphatidylinositol 3,4,5-tris-phosphate (PtdIns(3,4,5)P3) binding, without affecting catalytic activity. In the knockin cells, protein kinase B (PKB) was not activated by IGF1, whereas ribosomal S6 kinase (RSK) was activated normally, indicating that PtdIns(3,4,5)P3 binding to PDK1 is required for PKB but not RSK activation. Interestingly, amino acids and Rheb, but not IGF1, activated S6K in the knockin cells, supporting the idea that PtdIns(3,4,5)P3 stimulates S6K through PKB-mediated activation of Rheb. Employing PDK1 knockin cells in which either the PtdIns(3,4,5)P3 binding or substrate-docking 'PIF pocket' was disrupted, we established the roles that these domains play in regulating phosphorylation and stabilisation of protein kinase C isoforms. Moreover, mouse PDK1 knockin embryos in which either the PH domain or PIF pocket was disrupted died displaying differing phenotypes between E10.5 and E11.5. Although PDK1 plays roles in regulating cell size, cells derived from PH domain or PIF pocket knockin embryos were of normal size. These experiments establish the roles of the PDK1 regulatory domains and illustrate the power of knockin technology to probe the physiological function of protein-lipid and protein-protein interactions.