EIF4EとmRNA 5 '末端との相互作用に対する残基209および159での電荷変動の影響

真核生物翻訳開始因子4E（eIF4E）は、キャップ依存性翻訳における効率的なタンパク質合成に不可欠です。タンパク質は、mRNA 5 '末端でキャップ構造に特異的に結合し、mRNAのアセンブリを他の開始因子および40Sリボソームサブユニットと促進します。eif4eのリン酸化は、翻訳の開始ステップの調節に関係しています。ただし、この調節の分子メカニズムはまだ不明のままです。この問題に対処するために、蛍光測定時間合成滴定法による一連の新しいモノクレオチドキャップ類似体について、位置209または159で特異的に変異したeIF4Eの結合親和性を決定しました。リン酸鎖の負電荷に応じて、S209E変異体のCAPの親和性の1.5-3倍の減少とS209K変異体のCAPの親和性の1-2倍の増加は、SER209でのリン酸化がタンパク質と否定的な充電されたCAP構造の間の静電反発を生じることを示しています。K159A変異体とそのリン酸化されたカウンターパートによってCAP類似体を結合する能力の阻害は、キャップされたmRNAの結合にLYS159の有意な関与を示しています。構造修飾、リン酸化、リジンのアラニンの置換の両方が、キャップリン酸鎖の長さと添加剤の長さに比例する関連性の陰性ギブス自由エネルギーの増加をもたらします。特に「クランプモデル」について、リン酸化によるeIF4Eの制御メカニズムに対するこれらの結果の考えられる意味について説明します。

Eukaryotic translation initiation factor 4E (eIF4E) is essential for efficient protein synthesis in cap-dependent translation. The protein specifically binds the cap structure at the mRNA 5' terminus and facilitates the assembly of the mRNA with other initiation factors and the 40S ribosomal subunit. Phosphorylation of eIF4E is implicated in the regulation of the initiation step of translation. However, the molecular mechanism of this regulation still remains unclear. To address this problem, we have determined the binding affinities of eIF4E specifically mutated at position 209 or 159 for a series of novel mono- and dinucleotide cap analogues by a fluorometric time-synchronized titration method. A 1.5-3-fold reduction in the affinity of cap for the S209E mutant and a 1-2-fold increase in the affinity of cap for the S209K mutant, depending on the negative charge of phosphate chains, indicate that phosphorylation at Ser209 creates electrostatic repulsion between the protein and the negatively charged cap structure. The inhibition of the ability to bind cap analogues by the K159A mutant and its phosphorylated counterpart shows significant participation of Lys159 in the binding of the capped mRNA. Both structural modifications, phosphorylation and the replacement of lysine with alanine, result in an increase in the negative Gibbs free energy of association that is proportional to the length of the cap phosphate chain and additive, i.e., equal to the sum of the individual destabilizing changes of DeltaG degrees. The possible implication of these results for the mechanism of control of eIF4E by phosphorylation, especially for the "clamping model", is discussed.