シクロチドカラタB1の熱、化学、および酵素の安定性：環状システィンノットの重要性

シクロチドは、最近発見された植物由来のペプチドのファミリーを構成します。植物由来のペプチドは、頭から尾の環状骨格の異常な特徴とシスチン結び目コアです。これらの特徴は、家族の初期のメンバーのシーケンスと特徴づけを目的とした実験中に定性的に観察されるように、その並外れた安定性に貢献すると考えられています。しかし、これまでのところ、シクロチドの熱、化学、または酵素の安定性に関する定量的研究はありませんでした。この研究では、溶けに近づく温度まで、酸性塩性塩酸塩（GDHCl）および8 mの尿素塩性塩酸塩（GDHCl）および8 M尿素に対するプロトタイプのシクロチドカラタB1の安定性を示し、酸へ、および範囲の範囲とのインキュベーション、その下の条件の条件の後にほとんどのタンパク質は容易に展開します。NMR分光法を使用して熱の安定性を実証しましたが、蛍光と円形二色性を使用して化学的安定性を監視しました。Kalata B1のいくつかのバリアントも検査されました。これには、B1から5つのアミノ酸置換、骨格が壊れたがシスチン結びが保持されていた2つの非環式透過剤、2ジスルフィド結合変異体があります。一緒に、これらはシスチンノットの相対的な役割とシクロチドの安定性に対する円形の骨格の決定を可能にしました。Kalata B1または非環式透過剤に変性剤を添加しても、展開は発生しませんでしたが、二次元の誘導体は同様の3次元構造を持っているにもかかわらず、安定性が低くなりました。シスチン結び目は、シクロチドの化学的安定性における円形骨格よりも重要であると思われます。さらに、シクロチドのシスチン結びは、コノトキシンPVIIAとの比較によって判断すると、同様の分子のシスチンノットよりも安定しています。LC-MSで監視されているネイティブカラタB1の酵素消化の証拠はありませんでしたが、減少した形態は、トリプシン、エンドプロテイナーゼGlu-C、およびサーモリシンによるタンパク質分解の影響を受けやすいものでした。還元剤であるジチオトレイトールの存在下でのカラタB1の蛍光スペクトルは、隣接するCys5-Cys17ジスルフィド結合によるTRP残基に対する消光効果の除去が原因であると考えられる強度の顕著な増加を示しました。一般に、還元されたペプチドは、酸化種よりも化学的または酵素的分解の影響を受けやすくなりました。

The cyclotides constitute a recently discovered family of plant-derived peptides that have the unusual features of a head-to-tail cyclized backbone and a cystine knot core. These features are thought to contribute to their exceptional stability, as qualitatively observed during experiments aimed at sequencing and characterizing early members of the family. However, to date there has been no quantitative study of the thermal, chemical, or enzymatic stability of the cyclotides. In this study, we demonstrate the stability of the prototypic cyclotide kalata B1 to the chaotropic agents 6 M guanidine hydrochloride (GdHCl) and 8 M urea, to temperatures approaching boiling, to acid, and following incubation with a range of proteases, conditions under which most proteins readily unfold. NMR spectroscopy was used to demonstrate the thermal stability, while fluorescence and circular dichroism were used to monitor the chemical stability. Several variants of kalata B1 were also examined, including kalata B2, which has five amino acid substitutions from B1, two acyclic permutants in which the backbone was broken but the cystine knot was retained, and a two-disulfide bond mutant. Together, these allowed determinations of the relative roles of the cystine knot and the circular backbone on the stability of the cyclotides. Addition of a denaturant to kalata B1 or an acyclic permutant did not cause unfolding, but the two-disulfide derivative was less stable, despite having a similar three-dimensional structure. It appears that the cystine knot is more important than the circular backbone in the chemical stability of the cyclotides. Furthermore, the cystine knot of the cyclotides is more stable than those in similar-sized molecules, judging by a comparison with the conotoxin PVIIA. There was no evidence for enzymatic digestion of native kalata B1 as monitored by LC-MS, but the reduced form was susceptible to proteolysis by trypsin, endoproteinase Glu-C, and thermolysin. Fluorescence spectra of kalata B1 in the presence of dithiothreitol, a reducing agent, showed a marked increase in intensity thought to be due to removal of the quenching effect on the Trp residue by the neighboring Cys5-Cys17 disulfide bond. In general, the reduced peptides were significantly more susceptible to chemical or enzymatic breakdown than the oxidized species.