スライドクランプベータサブユニットとHDA、DNAA関連タンパク質の相互作用

大腸菌では、DNAポリメラーゼIII（スライドクランプタンパク質）のベータサブユニットである複製開始タンパク質DNAAと最近同定されたDNAA関連タンパク質のHDAとの相互作用が、DNAAの活性ATP結合形態を変換するために必要です。ATPの加速加水分解を介した不活性ADP結合形態。このATPの急速な加水分解は、細胞周期中の複数の開始をブロックし、開始から複製への分子スイッチとして機能する主なメカニズムであることが提案されています。ただし、DNA合成におけるこの重要なステップの生化学的メカニズムは解決されていません。プレート結合アッセイおよびNiニトリロトリア酢酸プルダウン分析で精製されたHDAおよびベータタンパク質を使用して、HDAがin vitroでベータと直接相互作用することを初めて示します。新しいベータ結合モチーフ、以前に特定されたベータ結合ペンタペプチドモチーフ（QL [SD] LF）に関連するコンセンサス配列QL [SP] LPLを備えたヘキサペプチドが、HDAタンパク質のアミノ末端で見つかりました。ヘキサペプチドモチーフのアミノ酸変化を伴うHDAの変異体は、ベータに結合する能力に重度に欠陥があります。大腸菌HDAベータ結合モチーフを含む10アミノ酸ペプチドは、HDAベータインタラクションアッセイでベータに結合するためにHDAと競合することが示されました。これらの結果は、HDAとベータの相互作用がヘキサペプチド配列を介して媒介されることを確立しています。この相互作用は、DNAAの不活性化と複製ラウンドの過剰開始の防止につながるイベントにとって重要である可能性があることを提案します。

In Escherichia coli, interactions between the replication initiation protein DnaA, the beta subunit of DNA polymerase III (the sliding clamp protein), and Hda, the recently identified DnaA-related protein, are required to convert the active ATP-bound form of DnaA to an inactive ADP-bound form through the accelerated hydrolysis of ATP. This rapid hydrolysis of ATP is proposed to be the main mechanism that blocks multiple initiations during cell cycle and acts as a molecular switch from initiation to replication. However, the biochemical mechanism for this crucial step in DNA synthesis has not been resolved. Using purified Hda and beta proteins in a plate binding assay and Ni-nitrilotriacetic acid pulldown analysis, we show for the first time that Hda directly interacts with beta in vitro. A new beta-binding motif, a hexapeptide with the consensus sequence QL[SP]LPL, related to the previously identified beta-binding pentapeptide motif (QL[SD]LF) was found in the amino terminus of the Hda protein. Mutants of Hda with amino acid changes in the hexapeptide motif are severely defective in their ability to bind beta. A 10-amino-acid peptide containing the E. coli Hda beta-binding motif was shown to compete with Hda for binding to beta in an Hda-beta interaction assay. These results establish that the interaction of Hda with beta is mediated through the hexapeptide sequence. We propose that this interaction may be crucial to the events that lead to the inactivation of DnaA and the prevention of excess initiation of rounds of replication.