光退色技術によるタンパク質のダイナミクスを明らかにする

緑色蛍光タンパク質（GFP）は、タンパク質を視覚化し、それらの細胞内分布を研究するための広く使用されているツールです。GFPバリアントを操作することの1つの特徴であるフォトブリーチは、最近、in vivoでタンパク質速度論を研究するために、光退色（FRAP）後に蛍光回復（FRAP）として知られる古い技術と組み合わされています。光退色中に、蛍光色素は、集中的な光源で繰り返される励起により不可逆的に破壊されます。光退色が制限された領域または構造に適用される場合、蛍光の回復は、漂白されていない周囲の領域からの蛍光分子からのアクティブまたはパッシブ拡散の結果となります。光退色（FLIP）の蛍光損失は、領域が漂白されているFRAPのバリアントであり、周囲の領域の蛍光の損失が観察されます。フリップは、タンパク質のさまざまなプールのダイナミクスを研究するために使用できます。また、タンパク質がどのように拡散するか、または細胞または細胞構造を介して輸送される方法を示すことができます。ここでは、Saccharomyces cerevisiaeフェロモン応答MAPK経路のタンパク質に適用されたこれらの技術の例で示されているこれらの光退色蛍光イメージング技術について説明します。

Green fluorescent proteins (GFPs) are widely used tools to visualize proteins and study their intracellular distribution. One feature of working with GFP variants, photobleaching, has recently been combined with an older technique known as fluorescence recovery after photobleaching (FRAP) to study protein kinetics in vivo. During photobleaching, fluorochromes get destroyed irreversibly by repeated excitation with an intensive light source. When the photobleaching is applied to a restricted area or structure, recovery of fluorescence will be the result of active or passive diffusion from fluorescent molecules from unbleached surrounding areas. Fluorescence loss in photobleaching (FLIP) is a variant of FRAP where an area is bleached, and loss of fluorescence in surrounding areas is observed. FLIP can be used to study the dynamics of different pools of a protein or can show how a protein diffuses, or is transported through a cell or cellular structure. Here, we discuss these photobleaching fluorescent imaging techniques, illustrated with examples of these techniques applied to proteins of the Saccharomyces cerevisiae pheromone response MAPK pathway.