興奮性アミノ酸輸送体、特にEAAT2とコレステロールが豊富な脂質ラフトマイクロドメインとの関連：興奮性アミノ酸輸送体の局在化と機能の重要性

本研究では、グルタミン酸輸送体の機能における膜コレステロールの役割を調査しました。メチルベータシクロデキストリンによる膜コレステロールの枯渇は、原発性皮質培養におけるNa（+）依存性グルタミン酸摂取の減少をもたらしました。グリアグルタミン酸トランスポーターEAAT2を介した取り込みは、この効果により敏感でした。細胞表面のビオチン化と免疫染色実験により、コレステロールの喪失により、EAAT2の輸送が原形質膜とその膜分布が大幅に変化したことが明らかになりました。これらの効果は、ニューロンのグルタミン酸トランスポーターEAAT3でも観察されましたが、それほどではありません。さらに、マウス脳血漿膜小胞をメチルベータシクロデキストリンによる治療は、グルタミン酸塩の取り込みを有意に減少させ、コレステロールの枯渇がグルタミン酸トランスポーターの機能に直接的な影響を与えることを示唆しています。血漿膜コレステロールは、脂質ラフトとして知られる慎重なマイクロドメイン内に局在しています。精製された脂質ラフトマイクロドメインの分析により、総EAAT2の大部分と総EAAT1、EAAT3、およびEAAT4の少数の部分が脂質ラフトと関連していることが明らかになりました。in vivoでの脂質ラフトの人工凝集により、細胞表面により大きなEAAT2免疫反応性クラスターが形成されました。精製された脂質ラフト関連画分は、Na（+）依存性グルタミン酸摂取が可能でした。我々のデータは、グルタミン酸輸送体、特にEAAT2は、原形質膜のコレステロールが豊富な脂質ラフトマイクロドメインと関連しており、これらのコレステロールが豊富なマイクロドメインとの関連が興奮性アミノ酸輸送体の局在と機能に重要であることを示唆しています。

In the present study, we investigated the role of membrane cholesterol in the function of glutamate transporters. Depletion of membrane cholesterol by methyl-beta-cyclodextrin resulted in reduced Na(+)-dependent glutamate uptake in primary cortical cultures. Glial glutamate transporter EAAT2-mediated uptake was more sensitive to this effect. Cell surface biotinylation and immunostaining experiments revealed that the loss of cholesterol significantly altered the trafficking of EAAT2 to the plasma membrane as well as their membrane distribution. These effects were also observed in neuronal glutamate transporter EAAT3 but to a lesser extent. Furthermore, the treatment of mouse brain plasma membrane vesicles with methyl-beta-cyclodextrin resulted in a significant reduction in glutamate uptake, suggesting that cholesterol depletion has a direct effect on the function of the glutamate transporters. Plasma membrane cholesterol is localized within discreet microdomains known as lipid rafts. Analyses of purified lipid raft microdomains revealed that a large portion of total EAAT2 and a minor portion of total EAAT1, EAAT3, and EAAT4 were associated with lipid rafts. Artificial aggregation of lipid rafts in vivo resulted in the formation of larger EAAT2-immunoreactive clusters on the cell surface. The purified lipid raft-associated fractions were capable of Na(+)-dependent glutamate uptake. Our data suggest that the glutamate transporters, especially EAAT2, are associated with cholesterol-rich lipid raft microdomains of the plasma membrane and that the association with these cholesterol-rich microdomains is important for excitatory amino acid transporter localization and function.