ライブセルの光退色補正FRET効率イメージング

蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）イメージング技術を使用して、タンパク質間相互作用をリアルタイムで細胞内解像度で視覚化できます。ドナーの励起中に誘発されたアクセプターの感作蛍光のイメージングは​​、既存のワイドフィールドまたは共焦点顕微鏡に適用できるため、ライブFRET（3キューブイメージング）の最も一般的な方法になりつつあります。最も感作された排出ベースのFRETインデックスは、分子相互作用の程度の変化に対して非線形に反応し、イメージングシステムの光学パラメーターに依存します。これにより、研究室間のFRETイメージングデータを評価および比較することが困難になります。さらに、光退色は、タイムラプス実験と3次元の再構成におけるFRETイメージングの問題を引き起こします。これらの障害の両方を克服する3キューブフレットイメージング法であるE-FRETを提示します。E-FRETは、アクセプター光退色技術（FRET効率の絶対測定を可能にしますが、生細胞には適していない）と感作FRETインデックス（生細胞のFRETを反映するが、欠如eの定量と明確性）。e-fretを使用すると、ドナーの相互作用の程度と直線的に相関する真のFRET効率画像（E）の観点からFRETを視覚化します。e-fretイメージングに光退色補正を組み込む手順を定義しました。Timelapseの光退色補正と、生きたT細胞における免疫学的シナプスにおけるタンパク質間相互作用の3次元イメージングを伴うE-Fretの利点を示します。

Fluorescent resonance energy transfer (FRET) imaging techniques can be used to visualize protein-protein interactions in real-time with subcellular resolution. Imaging of sensitized fluorescence of the acceptor, elicited during excitation of the donor, is becoming the most popular method for live FRET (3-cube imaging) because it is fast, nondestructive, and applicable to existing widefield or confocal microscopes. Most sensitized emission-based FRET indices respond nonlinearly to changes in the degree of molecular interaction and depend on the optical parameters of the imaging system. This makes it difficult to evaluate and compare FRET imaging data between laboratories. Furthermore, photobleaching poses a problem for FRET imaging in timelapse experiments and three-dimensional reconstructions. We present a 3-cube FRET imaging method, E-FRET, which overcomes both of these obstacles. E-FRET bridges the gap between the donor recovery after acceptor photobleaching technique (which allows absolute measurements of FRET efficiency, E, but is not suitable for living cells), and the sensitized-emission FRET indices (which reflect FRET in living cells but lack the quantitation and clarity of E). With E-FRET, we visualize FRET in terms of true FRET efficiency images (E), which correlate linearly with the degree of donor interaction. We have defined procedures to incorporate photobleaching correction into E-FRET imaging. We demonstrate the benefits of E-FRET with photobleaching correction for timelapse and three-dimensional imaging of protein-protein interactions in the immunological synapse in living T-cells.