大腸菌産の「非加水分解」UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼの活性部位変異体

「非加水分解」細菌UDP-N-アセチルグルコサミン2-エピメラーゼは、UDP-N-アセチルグルコサミン（UDP-GlCNAC）およびUDP-N-アセチルマンノサミン（UDP-Mannac）の可逆的相互変換を触媒します。このホモダイマー酵素は、その基質であるUDP-GlcNACによってアロステリックに活性化され、1つのサブユニットが調節的役割を果たし、他のサブユニットが触媒的役割を果たしていると考えられています。この研究では、5つの活性部位変異体を調製し（D95N、E117Q、E131Q、K15A、およびH213N）、結合、触媒、およびアロステリック調節に対する効果の観点から分析しました。His213はUDP結合に役割を果たすように見え、触媒および/または調節を支援する可能性もありますが、重要な触媒残基ではありません。Lys15は、結合にとって非常に重要であると思われます。カルボキシレート変異体の3つはすべて、K（CAT）の値の劇的な減少を示しましたが、K（M）の比較的影響を受けない値を示しました。したがって、これらの残基は触媒および/または調節において重要な役割を果たしています。E117Qの場合、反応中間体は、全体的な触媒作用に匹敵する速度で溶液に放出されます。これは、Glu117がUDP-GLCNACエピマー化反応の2番目のステップで酸/塩基触媒としての役割を果たしていることを示している可能性があります。3つのカルボキシレート変異体すべてが、アロステリックコントロール障害を示すことがわかった。

The "non-hydrolyzing" bacterial UDP-N-acetylglucosamine 2-epimerase catalyzes the reversible interconversion of UDP-N-acetylglucosamine (UDP-GlcNAc) and UDP-N-acetylmannosamine (UDP-ManNAc). This homodimeric enzyme is allosterically activated by its substrate, UDP-GlcNAc, and it is thought that one subunit plays a regulatory role, while that of the other plays a catalytic role. In this work, five active site mutants were prepared (D95N, E117Q, E131Q, K15A, and H213N) and analyzed in terms of their effects on binding, catalysis, and allosteric regulation. His213 appears to play a role in UDP binding and may also assist in catalysis and/or regulation, but is not a key catalytic residue. Lys15 appears to be quite important for binding. All three of the carboxylate mutants showed dramatic decreases in the value of k(cat) but relatively unaffected values of K(M). Thus, these residues are playing key roles in catalysis and/or regulation. In the case of E117Q, the reaction intermediates are released into solution at a rate comparable to that of the overall catalysis. This may indicate that Glu117 plays the role as an acid/base catalyst in the second step of the UDP-GlcNAc epimerization reaction. All three carboxylate mutants were found to exhibit impaired allosteric control.