グラム陰性菌における大型プラスミドの促進操作のための修正されたRP4およびTN5-MOB誘導体

多くのグラム陰性生物におけるレプリコンの動員を含む実験にアプリケーションを備えたRP4（NMS/TCS）およびTN5-MOB誘導体のセットを構築しました。RP4およびTN5-MOB誘導体のさまざまな選択マーカーには、ストレプトマイシン、クロラムフェニコール、ゲンタマイシン、スペクティノマイシン耐性、および水銀耐性、および構成的に発現したLACZ遺伝子が含まれます。このマーカーの選択により、多くの抗生物質に対して自然に耐性のある細菌、および既存の耐性プラスミド、トランスポゾン、または抗生物質カセット挿入を含む株でこれらの誘導体を使用できます。さらに、亜種のSACB遺伝子を運ぶRP4誘導体が構築されました。これにより、RP4が他のプラスミドを動員するために使用された後、RP4の喪失を選択できます。新しいマーカー（GM）を備えたTN5-MOB-SACB誘導体も開発されました。これは、SACB遺伝子を利用して既存のTN5インサートの他のTN5誘導体の置換を促進するベクターと同様に開発されました。これらのツールの使用の例として、3つのRhizobium lemuminosarum bv。共生症に関与していることが示されているVICIAE VF39プラスミドは、プラスミドを含まないアグロバクテリウムTUMEFACIENS株UBAPF2に対して差次的にタグ付けおよび動員（個別に、およびさまざまな組み合わせ）に動員されました。結果として生じるアグロバクテリウム株はどれも、エンドウ豆と共生において窒素を修正することができませんでした。

We have constructed a set of RP4 (NmS/TcS) and Tn5-Mob derivatives which have applications in experiments involving mobilization of replicons in many Gram-negative organisms. The different selection markers of the RP4 and Tn5-Mob derivatives include streptomycin, chloramphenicol, gentamicin, and spectinomycin resistance as well as mercury resistance, and a constitutively expressed lacZ gene. This choice of markers allows the use of these derivatives in bacteria which are naturally resistant to many antibiotics, and in strains which contain pre-existing resistance plasmids, transposons, or antibiotic cassette insertions. In addition, a RP4 derivative carrying the sacB gene of Bacillus subtilis was constructed. This allows the selection for the loss of RP4 after it has been used to mobilize other plasmids. A Tn5-Mob-sacB derivative with a new marker (Gm) was also developed, as were vectors which take advantage of the sacB gene to facilitate replacement of existing Tn5 inserts with other Tn5 derivatives. As an example of the use of these tools, three Rhizobium leguminosarum bv. viciae VF39 plasmids which have been shown to be involved in symbiosis were differentially tagged and mobilized (individually and in various combinations) to the plasmid-free Agrobacterium tumefaciens strain UBAPF2. None of the resultant Agrobacterium strains was able to fix nitrogen in symbiosis with peas.