Vectorette PCRを使用した大腸菌ゲノムの挿入シーケンスの迅速な識別とマッピング

背景：挿入シーケンス（IS）は、原核生物のゲノム内および間に転置できる小さなDNAセグメントであり、多くの場合、挿入変異と染色体再配置を引き起こします。微生物ゲノムのISを見つけるためにいくつかの方法が利用可能ですが、それらは労働集約型または非効率的です。ここでは、Vectorette PCRを使用して、8つの挿入シーケンス（IS1、2、3、4、5、30、150、および186）のゲノム位置を識別およびマッピングします。ゲノムが配列決定されています。 結果：CGSC6300株のゲノムDNAを4塩基カッターRSA Iで消化し、結果として得られた制限フラグメントがベクターセットユニットに結び付けられました。それぞれの極端な端から外側に向けられたIS固有のプライマーを使用して、ベクターレットプライマーで、隣接DNAフラグメントは、37の1つを除くすべてから増幅されました。PCR産物の精製と配列決定により、それらは、既知のIS MG1655ゲノムの位置に対応する隣接DNAフラグメントに関連する隣接DNAフラグメントであることが確認されました。CGSC6300株に7つの追加挿入が見つかりました。これは、同じ実験室株（K12分離株）の非常に密接に関連する分離株がIS補体で異なる可能性があることを示しています。他の2つの大腸菌K12誘導体、TD2およびTD10も、Vectorette PCRによって分析されました。MG1655のうち36はサイトであり、それぞれ16と18の追加挿入があります。 結論：この研究は、ベクターのPCRが微生物株を入力するための迅速で効率的で信頼できる方法であり、識別とマッピングが微生物ゲノムに存在する挿入部位であることを示しています。南部のハイブリダイゼーションや逆PCRとは異なり、私たちのアプローチには、1つのゲノムダイジェストと1つのライゲーションステップのみが含まれます。Vectorette PCRは、特定のタイプのすべての要素を同時に増幅するために使用され、ゲノムの要素を調査するための迅速で敏感な手段となります。微生物ゲノムのIS補体を迅速に識別する能力は、病気の発生中に密接に関連する病原体をサブタイピングすることを促進するはずです。

BACKGROUND: Insertion sequences (IS) are small DNA segments capable of transposing within and between prokaryotic genomes, often causing insertional mutations and chromosomal rearrangements. Although several methods are available for locating ISs in microbial genomes, they are either labor-intensive or inefficient. Here, we use vectorette PCR to identify and map the genomic positions of the eight insertion sequences (IS1, 2, 3, 4, 5, 30, 150, and 186) found in E. coli strain CGSC6300, a close relative of MG1655 whose genome has been sequenced. RESULTS: Genomic DNA from strain CGSC6300 was digested with a four-base cutter Rsa I and the resulting restriction fragments ligated onto vectorette units. Using IS-specific primers directed outward from the extreme ends of each IS and a vectorette primer, flanking DNA fragments were amplified from all but one of the 37 IS elements identified in the genomic sequence of MG1655. Purification and sequencing of the PCR products confirmed that they are IS-associated flanking DNA fragments corresponding to the known IS locations in the MG1655 genome. Seven additional insertions were found in strain CGSC6300 indicating that very closely related isolates of the same laboratory strain (the K12 isolate) may differ in their IS complement. Two other E. coli K12 derivatives, TD2 and TD10, were also analyzed by vectorette PCR. They share 36 of the MG1655 IS sites as well as having 16 and 18 additional insertions, respectively. CONCLUSION: This study shows that vectorette PCR is a swift, efficient, reliable method for typing microbial strains and identifying and mapping IS insertion sites present in microbial genomes. Unlike Southern hybridization and inverse PCR, our approach involves only one genomic digest and one ligation step. Vectorette PCR is then used to simultaneously amplify all IS elements of a given type, making it a rapid and sensitive means to survey IS elements in genomes. The ability to rapidly identify the IS complements of microbial genomes should facilitate subtyping closely related pathogens during disease outbreaks.