タンパク質切断および同位体希釈質量分析を使用したLC-MS/MSによる血清中のモデルバイオマーカーの前立腺特異抗原の絶対定量化

タンパク質切断 - アイソトープ希釈質量分析（PC-IDMS）を使用して、内部標準として使用されるペプチドフラグメントの同位体標識類似体を使用してタンパク質を定量化できます。ここでは、この手法によって血清からモデルバイオマーカーを直接定量化するための標準のLC-MS/MSプラットフォームの使用を調査します。PSAのN末端トリプティックフラグメントと同一のペプチド（IVGGWECEK）を合成しましたが、各グリシンには2つの13C原子と1つの15N原子が含まれています。PSAを含まないヒト血清は、尿素で変性した後、PSA標準と、内部標準ペプチドと標識された安定同位体の導入が続きました。次に、サンプルをトリプシンでタンパク質分解し、トリプル四重極質量分析計でLC-MS/ MSを使用して定量化しました。5つの異なる濃度のPSAから作られた線形最小二乗キャリブレーション曲線は、血清に添加され、消化された（それぞれ3回作られ、3回ランダムに注入された）平均勾配は0.973（SE = 0.023）で、-0.003（SE = 0.022）の切片がありました。、および0.971のR2。キャリブレーターの回復は70〜85％の範囲で、平均ラントランCVは13％、平均経営内CVは5.7％でした。PC-IDMSは、免疫測定法の標準化から翻訳後の修正の監視、イムノアッセイの開発と実装の前に新たに発見されたバイオマーカーの定量化まで、いくつかの名前を付けるだけで、幅広い用途をカバーするタンパク質を定量化するための有望な手法です。タンパク質の絶対定量化のためのPC-IDMSの適用を取り巻く問題には、広範な動的範囲で切断および分離できる定量化のためのタンパク質分解断片の選択、一貫した結果を与える安定した同位体標識合成ペプチド標準、およびLC-MS/非実用的な分析時間を作成せずに適切な感度と再現性を提供するMSメソッド。ここで提示された結果は、LC-MS/MSによって分析されたときに変性血清に導入されたモデルバイオマーカーPSAで絶対定量を実行できることを示しています。ただし、既存の免疫測定法と比較して、感度に関する懸念や、異なるマトリックスで実行されるPC-IDMの再現性が依然として存在します。

Protein cleavage-isotope dilution mass spectrometry (PC-IDMS) can be used to quantify proteins, with an isotope-labeled analogue of the peptide fragment used as an internal standard. Here, we investigate use of a standard LC-MS/MS platform for quantifying a model biomarker directly from serum by this technique. We synthesized a peptide (IVGGWECEK) identical to the N-terminal tryptic fragment of PSA but with each glycine containing two 13C atoms and one 15N atom. PSA-free human serum was denatured with urea followed by the introduction of PSA standard and the stable isotope labeled internal standard peptide. The sample was then proteolyzed with trypsin and subjected to quantification using LC-MS/ MS on a triple quadrupole mass spectrometer. A linear least squares calibration curve made from five different concentrations of PSA added to serum and digested (each made in triplicate and randomly injected three times) had a mean slope of 0.973 (SE = 0.023), intercept of -0.003 (SE = 0.022), and R2 of 0.971. Recovery of calibrators ranged from 70 to 85% with a mean run-to-run CV of 13% and a mean within-run CV of 5.7%. PC-IDMS is a promising technique for quantifying proteins covering a broad range of applications from standardizing immunoassays to monitoring post-translational modifications to quantifying newly discovered biomarkers prior to the development and implementation of an immunoassay, just to name a few. Issues surrounding the application of PC-IDMS for the absolute quantification of proteins include selection of a proteolytic fragment for quantification that can be cleaved and isolated reproducibly over a broad dynamic range, stable isotope labeled synthetic peptide standards that give consistent results, and LC-MS/MS methods that provide adequate sensitivity and reproducibility without creating impractical analysis times. The results presented here show that absolute quantification can be performed on the model biomarker PSA introduced into denatured serum when analyzed by LC-MS/MS. However, concerns still exist regarding sensitivity compared to existing immunoassays as well as the reproducibility of PC-IDMS performed in different matrixes.