アルカリホスファターゼの構造とメカニズム

アルカリホスファターゼは、3つの密接な間隔の金属イオン（2つのZnイオンと1つのmgイオン）が活性中心に存在する最初の亜鉛酵素が発見された最初の亜鉛酵素でした。3つの部位すべてのZnイオンも、最大活性酵素を生成します。これらの金属イオンには、中心から中心距離が3.9 A（Zn1-Zn2）、4.9 A（Zn2-Mg3）、7.1 A（Zn1-Mg3）です。これらの金属中心の密集にもかかわらず、1つのブリッジングリガンド、ASP51のカルボキシル、ブリッジZn2、およびMg3のみが。活性中心で形成された非共有リン酸複合体E.Pの2.0-A分解能の結晶構造は、2つのリン酸酸素がZn1とZn2の間にリン酸橋を形成し、他の2つのリン酸酸素がArg166のグアニジウム基と水素結合を形成することを示しています。。これにより、リン酸加水分解中にリン酸化されることが知られている残基であるSer102は、リンに対する求核攻撃を開始するために必要な頂端位置に配置されます。E.P構造の酵素 - 堆積複合体E.ropo4（2-）への外挿は、Zn1がエステル酸素を調整しなければならないという結論につながり、Ser102のリン酸化において脱離基を活性化します。同様に、Zn2はリン酸セリルのエステル酸素を調整し、ホスホサリル中間体の加水分解中に脱離基を活性化するようです。これらの発見の両方は、アルカリホスファターゼによって触媒されたリンの2つの変位のそれぞれに有意な解離性特性がある可能性があることを示唆しています。ホスホセリル中間体の形成後にZn1に調整された水分子（または水酸化物）は、メカニズムの2番目のステップでは求核試薬であると思われます。E.P中間体からの生成物リン酸の解離は、最も遅い35 S-1であり、したがって、アルカリpHでのメカニズムの速度制限ステップです。アルカリホスファターゼの初期結晶構造の測定以来、リン酸エステル加水分解に関与する酵素の他の2つの結晶構造が完了し、活性中心に存在する密接な間隔の亜鉛イオンのトライアドが示されています。これらの酵素は、Bacillus cereusのホスホリパーゼC（1.5-A分解能の構造）（43）およびPenicillium sitrinumのp1ヌクレアーゼ（2.8-A解像度の構造）（74）です。どちらの酵素もホスホジエスターを加水分解します。ホスホリパーゼCの基質はホスファチジルイノシトールおよびホスファチジルコリンであり、P1ヌクレアーゼは単一鎖リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチドを加水分解するエンドヌクレアーゼです。P1ヌクレアーゼは、ヌクレオチドの3'末端リン酸塩に対するホスホモンエステラーゼとしての活性もあります。両方の酵素のZnイオンは、ほぼ同一の三核部位を形成します（400語で切り捨てられた要約）

Alkaline phosphatase was the first zinc enzyme to be discovered in which three closely spaced metal ions (two Zn ions and one Mg ion) are present at the active center. Zn ions at all three sites also produce a maximally active enzyme. These metal ions have center-to-center distances of 3.9 A (Zn1-Zn2), 4.9 A (Zn2-Mg3), and 7.1 A (Zn1-Mg3). Despite the close packing of these metal centers, only one bridging ligand, the carboxyl of Asp51, bridges Zn2 and Mg3. A crystal structure at 2.0-A resolution of the noncovalent phosphate complex, E.P, formed with the active center shows that two phosphate oxygens form a phosphate bridge between Zn1 and Zn2, while the two other phosphate oxygens form hydrogen bonds with the guanidium group of Arg166. This places Ser102, the residue known to be phosphorylated during phosphate hydrolysis, in the required apical position to initiate a nucleophilic attack on the phosphorous. Extrapolation of the E.P structure to the enzyme-substrate complex, E.ROPO4(2-), leads to the conclusion that Zn1 must coordinate the ester oxygen, thus activating the leaving group in the phosphorylation of Ser102. Likewise, Zn2 appears to coordinate the ester oxygen of the seryl phosphate and activate the leaving group during the hydrolysis of the phosphoseryl intermediate. Both of these findings suggest that there may be a significant dissociative character to each of the two displacements at phosphorous catalyzed by alkaline phosphatase. A water molecule (or hydroxide) coordinated to Zn1 following formation of the phosphoseryl intermediate appears to be the nucleophile in the second step of the mechanism. Dissociation of the product phosphate from the E.P intermediate is the slowest, 35 s-1, and therefore the rate-limiting, step of the mechanism at alkaline pH. Since the determination of the initial crystal structure of alkaline phosphatase, two other crystal structures of enzymes involved in phosphate ester hydrolysis have been completed that show a triad of closely spaced zinc ions present at their active centers. These enzymes are phospholipase C from Bacillus cereus (structure at 1.5-A resolution) (43) and P1 nuclease from Penicillium citrinum (structure at 2.8-A resolution) (74). Both enzymes hydrolyze phosphodiesters. Substrates for phospholipase C are phosphatidylinositol and phosphatidylcholine, while P1 nuclease is an endonuclease hydrolyzing single stranded ribo- and deoxyribonucleotides. P1 nuclease also has activity as a phosphomonoesterase against 3'-terminal phosphates of nucleotides. The Zn ions in both enzymes form almost identical trinuclear sites.(ABSTRACT TRUNCATED AT 400 WORDS)