オーバーラップ拡張PCRによるアプタマー依存性フルレングスcDNA合成

計算注釈と組み合わせたヒトゲノムのシーケンスは、予測された遺伝子に関する途方もないデータを提供しました。ただし、それらのほとんどでは、対応するcDNAはまだ利用できません。さらに、cDNAクローンが得られたとしても、遺伝子転写産物にはしばしば、現在の遺伝子収集でカバーされていない多くの異なるスプライスバリアントがあります。予測された遺伝子、新しいスプライスバリアント、またはその他の関心のある遺伝子に対応するcDNAクローンの直接合成のために、特定のTAQアプタマーを必要とするゲノムDNAからのエクソンを直接増幅するための最適なPCR条件を確立しました。異なるタグ付けされたエクソンを含むPCR産物は、完全な長さのcDNAにオーバーラップ拡張によって連結されました。アプローチの有効性を証明するために、ヒトミトコンドリアアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ALDH2）遺伝子の1900 bpフルレングスオープンリーディングフレームは、13個すべてのエクソンを含む2段階の反応で合成されました。したがって、私たちの条件は、ゲノムDNAからのcDNAおよび代替スプライスバリアントのin vitro合成の一般的な価値があります。

Sequencing of the human genome in combination with computational annotation has provided tremendous data on predicted genes. However, for most of them, no corresponding cDNAs are available yet. Furthermore, even where cDNA clones were obtained, gene transcripts often have many different splice variants that are not covered by current gene collections. For direct synthesis of cDNA clones corresponding to predicted genes, new splice variants, or any other gene of interest, we established optimal PCR conditions for the direct amplification of exons from genomic DNA, which require a specific Taq aptamer. PCR products comprising differently tagged exons were concatenated by overlap extension into full-length cDNAs. To prove the effectiveness of the approach, the 1900-bp full-length open reading frame of the human mitochondrial aldehyde dehydrogenase (ALDH2) gene was synthesized in a two-step reaction comprising all 13 exons. Thus, our conditions are of general value for in vitro synthesis of cDNAs and alternative splice variants from genomic DNA.