緑色の蛍光タンパク質 - プロピジウムヨウ化物（GFP-PI）ベースの細菌生存率のフローサイトメトリー測定のためのアッセイ

背景：細菌の生存率のフローサイトメトリック分析のために、いくつかの染色プロトコルが開発されています。有望な方法の1つは、ライブ/デッドバクライト細菌の生存率キットを使用したデュアル染色です。この手順では、細胞は2つの異なるDNA結合色素（SYTO9およびPI）で処理され、生存率は結合した染色の割合に従って推定されます。SYTO9は無傷の細胞膜を拡散し、細胞DNAに結合しますが、PIは損傷した細胞のDNAのみに結合します。このデュアル染色方法により、実行可能な細胞と死んだ細胞間の効果的な分離が可能になり、単一染色で達成するのははるかに困難です。SYTO9-PIデュアル染色はさまざまな細菌の生存率分析に実用的ですが、この方法には多くの欠点があります。具体的には、細胞膜を通るSyto9の通過は遅いプロセスであり、細胞膜の完全性が破壊されると大幅に加速されます。その結果、DNAへのSYTO9結合は大幅に増強されます。PIはSYTO9と結合部位を競い合い、結合した色素を置き換える可能性があります。これらのプロパティは、ライブ/デッド実行可能性キットの信頼性を低下させます。この研究では、データの信頼性を改善するために、緑色の蛍光タンパク質（GFP）とPIの組み合わせを使用して、細菌の生存率を測定するための代替方法を調査します。 方法：クラゲGFPの遺伝子を含むプラスミドを含む組換え大腸菌細胞をPIで染色し、緑と赤の蛍光をFCMで測定しました。比較のために、GFPを除去したプラスミドを含む細胞をSYTO9およびPIで染色し、FCMによって分析しました。生存率は、緑と赤の蛍光の割合に従って推定されました。さらに、生物発光とプレートカウント（生存率を評価する他の方法）を参照手順として使用しました。 結果：細菌細胞のSYTO9-PIデュアル染色により、3つの異なる細胞集団が明らかになりました。これは、生、妥協、および死んだ細胞です。これらの細胞集団は、デュアル染色の代わりにGFP-PIの組み合わせを使用した場合、より明確でした。2つの方法の間に感度の違いは観察されませんでした。ただし、SYTO9のGFPの置換により、手順が加速されました。生物発光とプレートカウントの結果は、フローサイトメトリーの生存率データと一致していました。 結論：細菌の生存率分析では、GFP-PIの組み合わせは、SYTO9-PIデュアル染色よりも大腸菌細胞の電流生存段階をよりよく区別しました。さらに、全体的な手順はより迅速でした。感度の顕著な違いは観察されませんでした。

BACKGROUND: Several staining protocols have been developed for flow cytometric analysis of bacterial viability. One promising method is dual staining with the LIVE/DEAD BacLight bacterial viability kit. In this procedure, cells are treated with two different DNA-binding dyes (SYTO9 and PI), and viability is estimated according to the proportion of bound stain. SYTO9 diffuses through the intact cell membrane and binds cellular DNA, while PI binds DNA of damaged cells only. This dual-staining method allows effective separation between viable and dead cells, which is far more difficult to achieve with single staining. Although SYTO9-PI dual staining is practical for various bacterial viability analyses, the method has a number of disadvantages. Specifically, the passage of SYTO9 through the cell membrane is a slow process, which is significantly accelerated when the integrity of the cell membrane is disrupted. As a result, SYTO9 binding to DNA is considerably enhanced. PI competes for binding sites with SYTO9 and may displace the bound dye. These properties diminish the reliability of the LIVE/DEAD viability kit. In this study, we investigate an alternative method for measuring bacterial viability using a combination of green fluorescent protein (GFP) and PI, with a view to improving data reliability. METHODS: Recombinant Escherichia coli cells with a plasmid containing the gene for jellyfish GFP were stained with PI, and green and red fluorescence were measured by FCM. For comparison, cells containing the plasmid from which gfp was removed were stained with SYTO9 and PI, and analyzed by FCM. Viability was estimated according to the proportion of green and red fluorescence. In addition, bioluminescence and plate counting (other methods to assess viability) were used as reference procedures. RESULTS: SYTO9-PI dual staining of bacterial cells revealed three different cell populations: living, compromised, and dead cells. These cell populations were more distinct when the GFP-PI combination was used instead of dual staining. No differences in sensitivity were observed between the two methods. However, substitution of SYTO9 with GFP accelerated the procedure. Bioluminescence and plate counting results were in agreement with flow cytometric viability data. CONCLUSIONS: In bacterial viability analyses, the GFP-PI combination provided better distinction between current viability stages of E. coli cells than SYTO9-PI dual staining. Additionally, the overall procedure was more rapid. No marked differences in sensitivity were observed.