TunelとDAPI染色を組み合わせた神経細胞培養のSPLA2誘導初期および後期のアポトーシスの変化の定量化

末端デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ（TDT）DUTPニックエンド標識（TUNEL）染色は、他の細胞型だけでなく、ニューロンのアポトーシスの測定に幅広く使用されています。Tunelは、標識技術の変動と、非アポトーシスDNA鎖切断を受けた細胞の染色により、誤った陽性の結果をもたらす可能性があります。したがって、単独では、Tunelはアポトーシスの特定の指標ではありません。最近、ラットの原発性皮質ニューロンに対するグループIII（SPLA2-III）からの分泌されたホスホリパーゼA2の強力なアポトーシス効果を実証しました。ここでは、SPLA2-III誘導アポトーシス後にTUNEL陽性ニューロンを定量化するためのコンピューター支援方法について説明します。TUNELの範囲は、4 '、6-ジアミジノ-2-フェニルインドール（DAPI）染色を使用して総核含有量に正規化されます。さらに、DAPI対比染色により、核領域因子と呼ばれる核のサイズと丸みに基づいて、核の形態指標を決定できます。核面積因子は細胞死の初期指標であることがわかりました（治療後4時間後に重要）が、後の時期（26時間）でTUNEL染色が重要であることがわかりました。したがって、TunelとDAPIを使用した独立した染色技術は、互いに補完し、市販の画像分析ソフトウェアを使用して、細胞損傷プロセスの遅延と遅延したものを示すために使用できます。

The terminal deoxynucleotidyl transferase (TdT) dUTP nick end labeling (TUNEL) stain is in wide use for measuring apoptosis in neurons, as well as in other cell types. TUNEL may give false positive results due to variations in labeling technique as well as staining of cells that have undergone non-apoptotic DNA strand breaks. Therefore, in isolation, TUNEL is not a certain indicator of apoptosis. Recently, we have demonstrated the potent apoptotic effect of secreted phospholipase A2 from group III (sPLA2-III) on primary cortical neurons from rat. Here we describe a computer-assisted method for quantifying TUNEL-positive neurons after sPLA2-III induced apoptosis. Extent of TUNEL is normalized to total nuclear content using 4',6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining. Furthermore, DAPI counterstaining allows for determination of a nuclear morphology indicator, based on nuclear size and roundness, which we call the nuclear area factor. We found that the nuclear area factor is an early indicator of cell death (significant after 4 h post treatment), while TUNEL staining is significant at later times (26 h). Thus, the independent staining techniques using TUNEL and DAPI complement each other, and with commercially available image analysis software, may be used to indicate early as well as delayed cell injury processes.