生細胞および組織のミトコンドリア膜電位の変化を測定するためのミトトラッカーグリーンとcmxrosamineの有効性

背景：クロロメチル-X-ロサミン（CMXROS）およびミトトラッカーグリーン（MTG）は、ミトコンドリア機能を測定する有用な染料であることが証明されています。Cmxrosは、陰性ミトコンドリア膜電位（MMP）によってミトコンドリア内で濃縮される親油性カチオン性蛍光色素です。MTG蛍光は、MMPに依存しないミトコンドリア質量の尺度として使用されています。2つの染料の蛍光比は、ミトコンドリア質量とは無関係にMMPの相対的な尺度です。MTGは最近MMPに敏感であると報告されているため、フローサイトメトリーとレーザースキャン共焦点顕微鏡（LSCM）の両方を使用して、MTGおよびCmxros蛍光に対するMMPの喪失の影響を再評価しました。 方法：フローサイトメトリーを使用して、Cmxros、R123、およびMTGの相対蛍光を、MMPを崩壊させるために使用されるカルボニルドシアン化物P-トリフルオロメトキシルフェニル - ヒドラゾン（FCCP）を含むヒトリンパ芽球細胞株（LCL）で決定されました。LSCM分析は、マウス細胞のMTGおよびCMXROS蛍光および培養における実行可能なレンズに対するFCCPの効果を評価するためにも使用されました。染料の細胞毒性は、内因性NADH蛍光のフロー分析を使用して決定されました。H（2）O（2）に対するmtg蛍光の感度も、フローサイトメトリーを使用して評価されました。 結果：CMXROS蛍光はMMPに依存していましたが、MTG蛍光はFlowまたはLSCMのいずれかを使用してMMPの影響を受けませんでした。NADHレベルで決定されるように、細胞毒性の証拠なしに、テストされたすべての細胞型の両方の色素でミトコンドリアの特異的染色が見られました。H（2）O（2）細胞のMTG染色がわずかに増加した損傷。 結論：我々の結果は、CMXROSがMMPの相対的な変化の非毒性に敏感な指標であることを示していますが、MTGは、最適な染色条件が使用されれば、フローとLSCM分析の両方を使用して、MMPと酸化ストレスに対して比較的鈍感です。さらに、これらの染料は、LSCMを使用して、組織全体のミトコンドリアの形態と機能の研究に役立ちます。

BACKGROUND: Chloromethyl-X-rosamine (CMXRos) and MitoTracker Green (MTG) have proved to be useful dyes with which to measure mitochondrial function. CMXRos is a lipophilic cationic fluorescent dye that is concentrated inside mitochondria by their negative mitochondrial membrane potential (MMP). MTG fluorescence has been used as a measure of mitochondrial mass independent of MMP. The fluorescence ratio of the two dyes is a relative measure of the MMP independent of mitochondrial mass. Because MTG was recently reported to be sensitive to MMP, we have reevaluated the effects of loss of MMP on MTG and CMXRos fluorescence, using both flow cytometry and laser scanning confocal microscopy (LSCM). METHODS: Using flow cytometry, the relative fluorescence of CMXRos, R123, and MTG was determined in human lymphoblastoid cell lines (LCLs) with or without carbonyl cyanide p-trifluoromethoxylphenyl-hydrazone (FCCP), used to collapse the MMP. LSCM analysis was also used to evaluate the effect of FCCP on MTG and CMXRos fluorescence of mouse cells and viable lenses in culture. The cytotoxicity of the dyes was determined using flow analysis of endogenous NADH fluorescence. The sensitivity of MTG fluorescence to H(2)O(2) was also evaluated using flow cytometry. RESULTS: CMXRos fluorescence was dependent on MMP, whereas MTG fluorescence was not affected by MMP, using either flow or LSCM. Specific staining of mitochondria was seen with both dyes in all cell types tested, without evidence of cytotoxicity, as determined by NADH levels. H(2)O(2) damage slightly increased MTG staining of cells. CONCLUSIONS: Our results indicate that CMXRos is a nontoxic sensitive indicator of relative changes in MMP, whereas MTG is relatively insensitive to MMP and oxidative stress, using both flow and LSCM analyses, provided optimal staining conditions are used. In addition, these dyes can be useful for the study of mitochondrial morphology and function in whole tissues, using LSCM.