アデノ/AAVハイブリッドベクターによる機能的トランスゲンのヒトゲノムへの部位固有の統合

ヒトゲノムへの遺伝子導入ベクターの制御されていない挿入は、臨床的使用に関する重大な安全性の懸念を引き起こしています。野生型アデノ関連ウイルス（AAV）は、AAVS1とウイルス反転末端反復の両方を結合する特定のレプリカーゼ/インテグラゼタンパク質（REP）の活性を通じて、ヒト染色体19（AAVS1）の特定の部位にそのゲノムを挿入できます（AAVS1）itrs）。ただし、AAV由来のベクトルは、rep遺伝子を運ぶことはなく、サイト固有の統合特性を維持することはできません。AAV ITRに挟まれた統合カセットと、大容量のヘルパー依存性アデノウイルス（AD）ベクトルのフレームワークにおける緊密に調節された薬物誘導性の再発現カセットを運ぶ新しいハイブリッドベクターについて説明します。無傷のサイズと機能のITRフランクカセットの再依存性統合は、選択がない場合にヒトの原発細胞および細胞株で得られました。統合の大部分はサイト固有であり、AAVS1の1000 bp領域内で発生しました。統合接合部のゲノム全体のシーケンスは、非特異的統合が主に遺伝子間領域で発生したことを示しています。部位固有の統合は、AAVS1トランスジェニックマウスモデルでもin vivoで得られました：AD/AAVベクターの非毒性投与量の単一の尾静脈投与により、AAVS1特異的統合はすべての動物の肝臓から得られたDNAで検出され、シーケンスされました担当者の発現は薬物治療によって誘発されました。したがって、二本鎖DNAの非ランダム統合は、毒性がない場合にハイブリッドAD/AAVベクターの使用をex in vivoおよびin vivobyで得ることができます。

Uncontrolled insertion of gene transfer vectors into the human genome is raising significant safety concerns for their clinical use. The wild-type adeno-associated virus (AAV) can insert its genome at a specific site in human chromosome 19 (AAVS1) through the activity of a specific replicase/integrase protein (Rep) binding both the AAVS1 and the viral inverted terminal repeats (ITRs). AAV-derived vectors, however, do not carry the rep gene and cannot maintain site-specific integration properties. We describe a novel hybrid vector carrying an integration cassette flanked by AAV ITRs and a tightly regulated, drug-inducible Rep expression cassette in the framework of a high-capacity, helper-dependent adenoviral (Ad) vector. Rep-dependent integration of ITR-flanked cassettes of intact size and function was obtained in human primary cells and cell lines in the absence of selection. The majority of integrations were site specific and occurred within a 1000-bp region of the AAVS1. Genome-wide sequencing of integration junctions indicates that nonspecific integrations occurred predominantly in intergenic regions. Site-specific integration was obtained also in vivo, in an AAVS1 transgenic mouse model: upon a single tail vein administration of a nontoxic dose of Ad/AAV vectors, AAVS1-specific integrations were detected and sequenced in DNA obtained from the liver of all animals in which Rep expression was induced by drug treatment. Nonrandom integration of double-stranded DNA can therefore be obtained ex vivo and in vivoby the use of hybrid Ad/AAV vectors, in the absence of toxicity and with efficiency compatible with gene therapy applications.