システインプロテアーゼ阻害剤シスタチンを腫瘍細胞に送達するためのキャリアシステムとしてのポリ（ラクチド - コグリド）ナノ粒子

シスタチンは、細胞内システインプロテアーゼカテプシンBおよびLの腫瘍関連活性を阻害することができ、潜在的な抗がん剤として示唆されています。腫瘍細胞へのバイオアベイラビリティと送達を改善するために、ポリ（ラクチド-Co-グリコリド）（PLGA）ナノ粒子（NPS）に、システインプロテアーゼのモデルタンパク質阻害剤である鶏シスタチンを組み込みました。直径300〜350 nmのシスタチン搭載NPは、タンパク質の生物学的活性を保存するために低エネルギー乳化を使用して、二重エマルジョン溶媒溶媒拡散法によって調製しました。80マイクログ/mlを超える濃度でのPLGA NPおよびシスタチン充填PLGA NPは、MCF-10A Neot細胞に対して細胞毒性でしたが、最大5ミクロムの濃度では遊離シスタチンではありませんでした。シスタチンの生きたMCF-10A Neot細胞への取り込みを視覚化するために、Alexa Fluor 488標識シスタチンを搭載したNPを培地に加えました。それらは細胞に急速に内在化しましたが、自由標識シスタチンの摂取は非常に遅かった。NPSから放出されたシスタチンは、特定のZ-ARG-ARGクレシルバイオレット基質の分解によって検出されるように、カテプシンB活性を効果的に阻害しました。対照的に、同じ量の遊離シスタチンは細胞内カテプシンBの阻害を示さなかった。結果は、PLGA NPがタンパク質阻害剤を腫瘍細胞に迅速に送達するための有用なキャリアシステムであることを示しており、細胞内タンパク質溶解の効果的な阻害を可能にする。このアプローチは、細胞内標的に対して活動する他のタンパク質薬に適用できます。

Cystatins are able to inhibit the tumor-associated activity of intracellular cysteine proteases cathepsins B and L and have been suggested as potential anticancer drugs. We have incorporated chicken cystatin, a model protein inhibitor of cysteine proteases, in poly(lactide-co-glycolide) (PLGA) nanoparticles (NPs) to improve its bioavailability and delivery into tumor cells. Cystatin-loaded NPs, 300-350 nm in diameter, were prepared by the double emulsion solvent diffusion method using low energy emulsification to preserve the biological activity of the protein. PLGA NPs and cystatin-loaded PLGA NPs at concentrations higher than 80 microg/ml were cytotoxic towards MCF-10A neoT cells, but not free cystatin at concentrations up to 5 microM. To visualize the uptake of cystatin into living MCF-10A neoT cells, NPs loaded with Alexa Fluor 488-labeled cystatin were added to the culture medium. They rapidly internalized into the cells, whereas the uptake of free-labeled cystatin was very slow. Cystatin, released from the NPs, effectively inhibited cathepsin B activity, as detected by degradation of specific Z-Arg-Arg cresyl violet substrate. In contrast, the same amount of free cystatin showed no inhibition of intracellular cathepsin B. Our results show that PLGA NPs are a useful carrier system for rapid delivery of protein inhibitors into tumor cells, enabling effective inhibition of intracellular proteolysis. The approach can be applied to other protein drugs active against intracellular targets.