大腸菌からの組換えタンパク質の発現と精製：エラスチン様ポリペプチド融合とオリゴヒスチジン融合の比較

ポリペプチド（ELP）のような熱反応性エラスチンを使用して、ELPとの融合としてタンパク質が発現する場合、大腸菌培養のタンパク質を精製することができます。逆遷移サイクリング（ITC）と呼ばれるELP融合タンパク質の非クロマトグラフィー精製は、ELPタグによって与えられた可逆的可溶性分散相転移挙動を活用します。ここでは、クロラムフェニコールアセチルトランスフェラーゼ（CAT）、青色蛍光タンパク質（BFP）、チオレドキシン（TRX）、およびカルモジュリン（CALT）のELPおよびオリゴヒスチジン融合の発現と精製を、4時間の培養で化学誘導の化学誘導の両方のカルモジュリン（Calm）の発現と精製を定量的に比較して比較します。プラスミド媒介融合タンパク質遺伝子と化学誘導のない24時間の培養。総タンパク質含有量と機能活性は、各ITC精製ステップで定量化されました。CAT、BFP、およびTRXの場合、ELP融合タンパク質の24時間の非誘導培養により、4-H誘導培養によって得られたものと比較して、各融合タンパク質の収率が7倍増加し、計算された標的タンパク質収量は同等のオリゴヒスチジン融合のそれと同様です。これらのタンパク質の場合、融合タンパク質のITC精製は、アフィニティクロマトグラフィーと同様に、活性融合タンパク質の約75％の回復をもたらします。ただし、クロマトグラフィー浄化と比較して、ITCは安価で特殊な機器や試薬を必要としません。ITCはバッチ浄化プロセスであるため、より大きな培養ボリュームに対応するために簡単に拡大するか、ハイスループット、マイクロスケールの浄化のためにマルチプレックスされます。したがって、プロテオミクスの高スループットタンパク質発現と精製の両方に潜在的に影響を与え、薬学的に関連するタンパク質の大規模で費用対効果の高い産業バイオプロセシングの両方に影響を与えます。

Thermally responsive elastin like polypeptides (ELPs) can be used to purify proteins from Escherichia coli culture when proteins are expressed as a fusion with an ELP. Nonchromatographic purification of ELP fusion proteins, termed inverse transition cycling (ITC), exploits the reversible soluble-insoluble phase transition behavior imparted by the ELP tag. Here, we quantitatively compare the expression and purification of ELP and oligohistidine fusions of chloramphenicol acetyltransferase (CAT), blue fluorescent protein (BFP), thioredoxin (Trx), and calmodulin (CalM) from both a 4-h culture with chemical induction of the plasmid-borne fusion protein gene and a 24-h culture without chemical induction. The total protein content and functional activity were quantified at each ITC purification step. For CAT, BFP, and Trx, the 24-h noninduction culture of ELP fusion proteins results in a sevenfold increase in the yield of each fusion protein compared to that obtained by the 4-h-induced culture, and the calculated target protein yield is similar to that of their equivalent oligohistidine fusion. For these proteins, ITC purification of fusion proteins also results in approximately 75% recovery of active fusion protein, similar to affinity chromatography. Compared to chromatographic purification, however, ITC is inexpensive, requires no specialized equipment or reagents, and because ITC is a batch purification process, it is easily scaled up to accommodate larger culture volumes or scaled down and multiplexed for high-throughput, microscale purification; thus, potentially impacting both high-throughput protein expression and purification for proteomics and large scale, cost-effective industrial bioprocessing of pharmaceutically relevant proteins.