モルモットの心臓筋細胞とクローン型HERG（I（KR））チャネルの比較薬理学

はじめに：この研究では、クローン化されたヒトエーテルエーテルゴーゴー関連遺伝子（HERG）を発現する隔離されたモルモット脳室細胞とHEK293細胞の全細胞、パッチクランプ技術を使用して、QT間隔の延長とトーサデスdeを引き起こす薬物の作用を調べました人間の声（TDP）。心臓筋細胞とクローン化されたHERG I（KR）チャネルに対する薬物作用の類似性と重要な違いが確立されました。心筋細胞に対する薬物の定性的作用は、Purkinje Fibersから得られた結果と、動物およびヒトのテレメトリー研究におけるQT間隔延長の測定に対応していました。 方法と結果：成体モルモットの心室筋細胞は、酵素消化により分離されました。細胞を33-35度CでTyrodeの溶液で継続的に灌流しました。記録は、全細胞のパッチクランプ技術を使用して作成されました。活動電位（AP）は、現在のクランプの下で誘発されました。電圧クランプを使用して、I（KR）（遅延整流器カリウム電流を急速に活性化する）、I（NA）（ナトリウム電流）、およびI（CA）（Lタイプのカルシウム電流）に対する薬物の効果を研究しました。ドフェチリドは、筋細胞活動の電位持続時間（APD）を濃度依存的に増加させ、PIC50は7.3でした。Dofetilide 1 MicroMは、早期後極分解（EAD）を誘発しましたが、I（CA）またはI（NA）にはほとんど影響を与えませんでした。E-4031は、濃度依存的にAPDを増加させ、PIC50は7.2です。対照的に、10ミクロムロラタジン、デスロラタジン、およびセチリジンは、APDまたはI（KR）にほとんど影響を与えませんでした。興味深いことに、シサプライドは筋細胞APDに二相性効果を示し、1ミクロムでI（CA）を阻害しました。この高濃度でさえ、シサプライドはEadsを誘発しませんでした。多くのアストラゼネカ化合物が心筋細胞でテストされ、HEK293細胞のHERG電流では観察されなかった薬物作用の混合物が明らかになりました。1つの化合物、特にAR-C0Xは、筋細胞AP（8.4のPIC50）の強力なブロッカーでした。AR-C0Xはまた、心筋細胞のEADを誘発しました。クローン化されたハーグチャネル上の同じ薬物セットの効力も評価されました。ドフェチリド、E-4031、テルフェナジン、ロラタジン、デスロラタジン、およびセチリジンのPIC50値は、それぞれ6.8、7.1、7.3、5.1、5.2、および<4でした。22〜35度Cの温度の上昇は、現在のherの電流の現在の速度論と振幅を大幅に高め、E-4031効力の約5倍の増加をもたらしました。 結論：私たちの研究は、人間のQT間隔延長とTDPの予測において、異種のHERGチャネルよりも心筋細胞の利点を示しています。心筋細胞の一部の薬物の効力はHERGに類似していたが、筋細胞のみがAPD特性の重要な変化を検出し、不整脈の発達を予測するEADを示すことができる。心臓筋細胞、犬のプルキンエ繊維、動物およびヒトのテレメトリー研究で同様の質的薬物プロファイルを観察しました。したがって、分離された天然の心筋細胞は、異種発現したHERGチャネルよりも、薬物誘発QT延長とTDPのより良い予測因子です。分離された心筋細胞は、ハイスループットパッチクランプ機器で使用する場合、創薬の初期段階で潜在的な心毒性化合物をスクリーニングする上で重要な役割を果たしている可能性があります。これにより、前臨床および/または臨床開発に入る薬物の消耗速度が大幅に低下します。クローン化されたHergチャネルの現在の速度と振幅は、温度によって大きく影響を受け、1つの薬物の効力を大幅に変化させました（E-4031）。この発見は、クローン化されたHERGチャネルを使用する際の生理学的温度と比較して、室温での日常的な薬物検査に対する注意を払っています。

INTRODUCTION: This study used whole-cell, patch clamp techniques on isolated guinea pig ventricular myocytes and HEK293 cells expressing cloned human ether-a-go-go-related gene (hERG) to examine the action of drugs causing QT interval prolongation and torsades de pointes (TdP) in man. Similarities and important differences in drug actions on cardiac myocytes and cloned hERG I(Kr) channels were established. Qualitative actions of the drugs on cardiac myocytes corresponded with results obtained from Purkinje fibers and measurement of QT interval prolongation in animal and human telemetry studies. METHODS AND RESULTS: Adult guinea pig ventricular myocytes were isolated by enzymatic digestion. Cells were continuously perfused with Tyrode's solution at 33-35 degrees C. Recordings were made using the whole-cell, patch clamp technique. Action potentials (APs) were elicited under current clamp. Voltage clamp was used to study the effect of drugs on I(Kr) (rapidly activating delayed rectifier potassium current), I(Na) (sodium current), and I(Ca) (L-type calcium current). Dofetilide increased the myocyte action potential duration (APD) in a concentration-dependent manner, with a pIC50 of 7.3. Dofetilide 1 microM elicited early afterdepolarizations (EADs) but had little affect on I(Ca) or I(Na). E-4031 increased APD in a concentration-dependent manner, with a pIC50 of 7.2. In contrast, 10 microM loratadine, desloratadine, and cetirizine had little effect on APD or I(Kr). Interestingly, cisapride displayed a biphasic effect on myocyte APD and inhibited I(Ca) at 1 microM. Even at this high concentration, cisapride did not elicit EADs. A number of AstraZeneca compounds were tested on cardiac myocytes, revealing a mixture of drug actions that were not observed in hERG currents in HEK293 cells. One compound, particularly AR-C0X, was a potent blocker of myocyte AP (pIC50 of 8.4). AR-C0X also elicited EADs in cardiac myocytes. The potencies of the same set of drugs on the cloned hERG channel also were assessed. The pIC50 values for dofetilide, E-4031, terfenadine, loratadine, desloratadine, and cetirizine were 6.8, 7.1, 7.3, 5.1, 5.2, and <4, respectively. Elevation of temperature from 22 to 35 degrees C significantly enhanced the current kinetics and amplitudes of hERG currents and resulted in approximately fivefold increase in E-4031 potency. CONCLUSION: Our study demonstrates the advantages of cardiac myocytes over heterologously expressed hERG channels in predicting QT interval prolongation and TdP in man. The potencies of some drugs in cardiac myocytes were similar to hERG, but only myocytes were able to detect important changes in APD characteristics and display EADs predictive of arrhythmia development. We observed similar qualitative drug profiles in cardiac myocytes, dog Purkinje fibers, and animal and human telemetry studies. Therefore, isolated native cardiac myocytes are a better predictor of drug-induced QT prolongation and TdP than heterologously expressed hERG channels. Isolated cardiac myocytes, when used with high-throughput patch clamp instruments, may have an important role in screening potential cardiotoxic compounds in the early phase of drug discovery. This would significantly reduce the attrition rate of drugs entering preclinical and/or clinical development. The current kinetics and amplitudes of the cloned hERG channel were profoundly affected by temperature, significantly altering the potency of one drug (E-4031). This finding cautions against routine drug testing at room temperature compared to physiologic temperature when using the cloned hERG channel.