培養細胞におけるファルネシルとゲラニルジェラニルピロリン酸レベルの同時測定

培養細胞におけるファルネシルピロリン酸（FPP）とゲラニルピロリン酸（GGPP）の濃度を同時に決定するために、敏感で非放射性分析方法が開発されました。抽出後、組換えファルネシルタンパク質トランスフェラーゼまたはゲラニルジェラニルタンパク質トランスフェラーゼを含む酵素アッセイを、FPPまたはGGPPをダンシル化ペプチドに結合させるために行われます。次に、反応生成物を分離し、励起波長335 nmおよび発光波長528 nmの蛍光検出器に結合した高性能液体クロマトグラフィーによって定量化されます。ファルネシルペプチドとゲラニルジェラニルペプチドの保持時間は、それぞれ8.4および16.9分です。検出の下限は、FPPまたはGGPPの5 pg（約0.01 pmol）です。5〜1000 pg（約0.01〜2mol）の範囲で線形応答が確立されており、再現性が良好です。この方法は、NIH3T3細胞のFPP（0.125 +/- 0.010 PMOL/10（6）細胞）およびGGPP（0.145 +/- 0.008 PMOL/10（6）細胞）のレベルを決定するために使用されています。さらに、イソプレノイド生合成経路阻害剤による細胞の治療後のFPPおよびGGPPレベルの変化が測定されました。この方法は、あらゆる細胞型または組織におけるFPPおよびGGPPの濃度の測定に適しています。

A sensitive, nonradioactive analytical method has been developed to simultaneously determine the concentrations of farnesyl pyrophosphate (FPP) and geranylgeranyl pyrophosphate (GGPP) in cultured cells. Following extraction, enzyme assays involving recombinant farnesyl protein transferase or geranylgeranyl protein transferase I are performed to conjugate FPP or GGPP to dansylated peptides. The reaction products are then separated and quantified by high-performance liquid chromatography coupled to a fluorescence detector at the excitation wavelength 335 nm and the emission wavelength 528 nm. The retention times for farnesyl-peptide and geranylgeranyl-peptide are 8.4 and 16.9 min, respectively. The lower limit of detection is 5 pg of FPP or GGPP ( approximately 0.01 pmol). A linear response has been established over a range of 5-1000 pg ( approximately 0.01-2 pmol) with good reproducibility. The method has been used to determine the levels of FPP (0.125+/-0.010 pmol/10(6)cells) and GGPP (0.145+/-0.008 pmol/10(6)cells) in NIH3T3 cells. Furthermore, changes in FPP and GGPP levels following treatment of cells with isoprenoid biosynthetic pathway inhibitors were measured. This method is suitable for the determination of the concentrations of FPP and GGPP in any cell type or tissue.