Alexa-488およびFam fluorophoresで標識されたハイブリダイングオリゴヌクレオチドの蛍光特性に対する覆わいヌクレオチドの効果

リアルタイムPCRのプローブを合理的に選択および設計するために、ハイブリダイングプローブから得られる蛍光に対する相補的鎖のオーバーハング領域の影響を決定しました。それぞれがユニークな3 'オーバーハング（4塩基）を備えた一連の標的オリゴヌクレオチドは、5'フルオレセイン（FAM）またはALEXA-488ラベルのプローブのいずれかにハイブリダイズされ、蛍光特性の変化が監視されました。標的オリゴヌクレオチドのオーバーハング領域のグアニン塩基の数は、FAMとAlexa-488の両方の染料の両方で観察される蛍光消光量に比例することがわかりました。FAMは、3つのグアニン塩基と4つのグアニン塩基を伴うグアニン誘発の消光により敏感であるように見え、非オーバーハンのターゲットと比較して、フルオロフォアの量子収率が2倍以上減少しました。さらに、アデニン塩基がAlexa-488標識プローブの蛍光消光を引き起こしたのに対し、Fam-Labelled Probeは鈍感であると思われることがわかりました。定常状態の蛍光測定で生成された消光データは、蛍光熱サイクラーを使用して得られたものと線形相関を示し、リアルタイムPCR測定への適用性を示唆しています。一連の二重鎖からの異方性データは、蛍光量子収量と相関しており、消光には染料の可動性が増加することを示唆しています。

In order to rationally select and design probes for real-time PCR, we have determined the influence of the overhang region of the complementary strand on the resulting fluorescence from a hybridising probe. A series of target oligonucleotides, each with a unique 3' overhang (4 bases), was hybridised to either 5' fluorescein (FAM)- or Alexa-488-labelled probes, and the changes in fluorescence properties were monitored. We found that the number of guanine bases in the overhang region of the target oligonucleotides was proportional to the amount of fluorescence quenching observed for both the FAM and Alexa-488 dyes. FAM appeared to be more sensitive to guanine-induced quenching with three and four guanine bases resulting in greater than a twofold decrease in the quantum yield of the fluorophore compared to the no-overhang target. In addition, we found that adenine bases caused fluorescence quenching of the Alexa-488-labelled probe, whereas the FAM-labelled probe appeared insensitive. The quenching data, generated with the steady-state fluorescence measurements, displayed a linear correlation with that obtained using a fluorescent thermal cycler, suggesting the applicability to real-time PCR measurements. Anisotropy data from the series of duplexes correlated with the fluorescence quantum yield, suggesting that quenching was accompanied by increased dye mobility.