第2世代のテトラサイクリン応答性プロモーターを含むレンチウイルスベクターによる導入遺伝子発現の密接な制御

背景：この研究の目標は、規制可能なレンチウイルスベクターシステムを改善することでした。目的は、ドキシサイクリン（DOX）誘導因子とDOXの存在下での高い導入遺伝子発現レベルの非存在下での低いバックグラウンド発現を示すTET-ONシステムに基づいて、テトラサイクリン（TET）のレンチウイルスベクターを設計することでした。 方法：誘導性の第1世代または第2世代のテット応答性プロモーター要素（TRE）の誘導性発現と第2レンチウイルスベクターをエンコードする誘導性のテット応答性プロモーター要素（TRE）で構成されるバイナリレンチウイルスベクターシステムを構築しました。DOXの存在下でTREからの導入遺伝子発現を活性化する逆テトラサイクリン制御トランステイベーター（RTTA）。 結果：多くの異なるRTTAを評価し、RTTA2S-M2を発見して、最高レベルの導入遺伝子発現を誘導しました。調節された導入遺伝子発現は、最大11週間ヌードマウスに移植されたヒト乳がん細胞で安定していました。バックグラウンド発現レベルを最小限に抑えるために、チキンベータグロビンCHS4絶縁体要素を、導入遺伝子移動ベクターの3 '長末端繰り返し（LTR）にクローニングしました。CHS4絶縁体要素はバックグラウンド発現を減少させましたが、DOX添加後の発現レベルは、絶縁体配列を欠くベクターで観察されたものよりも低かった。2番目の戦略では、再配置されたテトラサイクリン演算子要素を抱える第2世代のTRESを持つベクターが使用されました。このようなベクトルは、DOXの非存在下で漏れを大幅に減少させ、誘導性導入遺伝子発現レベルは、DOXの非存在下で見られたものよりも最大522倍上でありました。 結論：絶縁体または第2世代のTREを持つ誘導性レンチウイルスベクターは、背景表現の最低レベルを要求するアプリケーションに有用であることが証明されるでしょう。

BACKGROUND: The goal of this study was to design improved regulatable lentivirus vector systems. The aim was to design tetracycline (tet)-regulatable lentivirus vectors based on the Tet-on system displaying low background expression in the absence of the doxycycline (DOX) inducer and high transgene expression levels in the presence of DOX. METHODS: We constructed a binary lentivirus vector system that is composed of a self-inactivating (SIN) lentivirus vector bearing inducible first- or second-generation tet-responsive promoter elements (TREs) driving expression of a transgene and a second lentivirus vector encoding a reverse tetracycline-controlled transactivator (rtTA) that activates transgene expression from the TRE in the presence of DOX. RESULTS: We evaluated a number of different rtTAs and found rtTA2S-M2 to induce the highest levels of transgene expression. Regulated transgene expression was stable in human breast carcinoma cells implanted into nude mice for up to 11 weeks. In an attempt to minimize background expression levels, the chicken beta-globin cHS4 insulator element was cloned into the 3' long terminal repeat (LTR) of the transgene transfer vector. The cHS4 insulator element reduced background expression but expression levels following DOX addition were lower than those observed with vectors lacking an insulator sequence. In a second strategy, vectors bearing second-generation TREs harboring repositioned tetracycline operator elements were used. Such vectors displayed greatly reduced leakiness in the absence of DOX and induced transgene expression levels were up to 522-fold above those seen in the absence of DOX. CONCLUSIONS: Inducible lentivirus vectors bearing insulators or second-generation TREs will likely prove useful for applications demanding the lowest levels of background expression.