Escherichia coli Farnesyl diphhate Synthase（ISPA）の監督された進化は、鎖長特異性の新しい構造決定因子を明らかにします

大腸菌のファルネシル二リン酸（FPP、C15）シンターゼ（ISPA）の監督された進化は、C40カロテノイド経路酵素を使用した色補体スクリーンを使用して誤差補体PCRによって実行されました。これにより、C40カロテノイド前駆体ゲラニルジェラニル二リン酸（GGPP、C20）の産生が強化されたISPA変異体を容易に同定することができました。これらの変異体の分析は、この酵素の製品チェーン長特異性のメカニズムをよりよく理解するために実施されました。C20 GGPP産生が強化された12の進化したクローンは、プレニル二リン酸シンターゼ（指定領域IからVII）の保存された領域に特徴的な変異を持っています。これらの変異のいくつか（I76T、Y79S、Y79H、C75Y、H83Y、およびH83Q）は、保存された最初のアスパラギン酸リッチモチーフ（農場）の近くまたは前に見られます。分子モデリングは、以前に報告されていない農場の上流と9番目のアミノ酸での置換を含む、これらの変異の鎖長測定のメカニズムを示唆しました。さらに、基質結合ポケット（D115G）内の農場に隣接するヘリックスの突然変異は、鎖長測定の新しいメカニズムを示唆しています。1つの変異体ISPAクローンは、保存領域IV（GQXXDL）の上流の2番目のアミノ酸でC155Gの変異を持ち、最近、III型GGPPシンターゼの鎖伸長を制御する重要な領域であることがわかった。1つのISPAクローンは、保存された第2のアスパラギン酸リッチモチーフ（SARM）の近くで変異（T234AおよびT249I）を運びます。変異体クローンのin vivo活性（C40カロテノイド形成として表される）の検証として、in vitroアッセイを使用して野生型および変異体ISPAの生成物分布を確認しました。

Directed evolution of farnesyl diphosphate (FPP, C15) synthase (IspA) of Escherichia coli was carried out by error-prone PCR with a color complementation screen utilizing C40 carotenoid pathway enzymes. This allowed IspA mutants with enhanced production of the C40 carotenoid precursor geranylgeranyl diphosphate (GGPP, C20) to be readily identified. Analysis of these mutants was carried out in order to better understand the mechanisms of product chain length specificity in this enzyme. The 12 evolved clones having enhanced C20 GGPP production have characteristic mutations in the conserved regions of prenyl diphosphate synthases (designated regions I through VII). Some of these mutations (I76T, Y79S, Y79H, C75Y, H83Y, and H83Q) are found near or before the conserved first aspartate rich motif (FARM), which is involved in the mechanism for chain elongation reaction of all prenyl synthases. Molecular modeling suggested a mechanism for chain length determination for these mutations including substitutions at the 1st and 9th amino acids upstream of the FARM that have not been reported previously. In addition, a mutation on a helix adjacent to the FARM within the substrate-binding pocket (D115G) suggests a novel mechanism for chain length determination. One mutant IspA clone carries a mutation of C155G at the 2nd amino acid upstream of conserved region IV (GQxxDL), which was recently found to be an important region controlling the chain elongation of a Type III GGPP synthase. One IspA clone carries mutations (T234A and T249I) near the conserved second aspartate rich motif (SARM). As a verification of the in vivo activity of the mutant clones (represented as C40 carotenoid formation), we confirmed the product distribution of wild-type and mutant IspA using an in vitro assay.