空間的画像相関分光法（STICS）理論、検証、およびリビングチョセルのタンパク質速度マッピングへの応用

画像相関分光法（ICS）と画像相互相関分光法（ICC）の新しい拡張を導入し、レーザースキャン顕微鏡画像シリーズからの強度変動の時間的および空間相関遅延の完全な分析に依存しています。この新しいアプローチにより、完全な時空相関関数の時間進化をモニタリングすることにより、生細胞の蛍光標識膜タンパク質の拡散係数と速度ベクトル（大きさと方向）の両方を測定できます。フーリエ空間でフィルタリングを使用して、動かない成分に関連する周波数を除去することにより、不動の種の大部分（> 90％）の存在下でもタンパク質輸送を測定できます。蛍光微小球の背景理論、コンピューターシミュレーション、および測定の分析を提示して、メソッドの原理、能力、および制限の証明を実証します。時空画像の相互相関を使用して、異なる排出波長を持つ蛍光マイクロスフィアを含む混合サンプルのフローベクトルのマッピングを示します。また、生きているCHO細胞の基底膜におけるα-アクチニン/強化された緑色蛍光タンパク質融合構築物の2光子レーザースキャン顕微鏡研究の結果を提示します。時空画像相関分光法（STICS）を使用して、接着細胞の層状領域と突起からママ/分の大きさでタンパク質フラックスを測定することができます。また、相関する方向の流れ（ママ/分の大きさ）の測定と相互作用するアルファ5インテグリン/強化されたシアン蛍光タンパク質とアルファ - アクチニン/生の黄色の蛍光タンパク質の生きたCHO細胞内の拡散を示します。STICS方法により、タンパク質濃度が高すぎて単一の粒子追跡測定を実行できない場合でも、基底膜の小領域内のタンパク質の完全な輸送マップを生成することができます。

We introduce a new extension of image correlation spectroscopy (ICS) and image cross-correlation spectroscopy (ICCS) that relies on complete analysis of both the temporal and spatial correlation lags for intensity fluctuations from a laser-scanning microscopy image series. This new approach allows measurement of both diffusion coefficients and velocity vectors (magnitude and direction) for fluorescently labeled membrane proteins in living cells through monitoring of the time evolution of the full space-time correlation function. By using filtering in Fourier space to remove frequencies associated with immobile components, we are able to measure the protein transport even in the presence of a large fraction (>90%) of immobile species. We present the background theory, computer simulations, and analysis of measurements on fluorescent microspheres to demonstrate proof of principle, capabilities, and limitations of the method. We demonstrate mapping of flow vectors for mixed samples containing fluorescent microspheres with different emission wavelengths using space time image cross-correlation. We also present results from two-photon laser-scanning microscopy studies of alpha-actinin/enhanced green fluorescent protein fusion constructs at the basal membrane of living CHO cells. Using space-time image correlation spectroscopy (STICS), we are able to measure protein fluxes with magnitudes of mum/min from retracting lamellar regions and protrusions for adherent cells. We also demonstrate the measurement of correlated directed flows (magnitudes of mum/min) and diffusion of interacting alpha5 integrin/enhanced cyan fluorescent protein and alpha-actinin/enhanced yellow fluorescent protein within living CHO cells. The STICS method permits us to generate complete transport maps of proteins within subregions of the basal membrane even if the protein concentration is too high to perform single particle tracking measurements.