虚血症後の脳内皮細胞アポトーシス：PARP活性化の役割とAIF転座

脳虚血再灌流は、内皮細胞の損傷または死を特徴とする血管機能障害につながります。本研究では、in vitroモデルを使用して、一時的な虚血再灌流後にヒト脳微小血管内皮細胞（HBMEC）損傷のメカニズムを解明しました。ほぼ矛盾したHBMEC培養物は、断続的な低酸素再酸素化（HX/RO）にさらされ、異なる回復時点で、細胞生存率がMTTアッセイ、末端デオキシノクレオチジル媒介媒介2'-ジオキシリジン媒介5'-ジオキシリジン媒介5'-ジオキシリジン媒介5'-ジオキシル化微小酵素媒介5'-ジオキシ系媒介性微小顕微鏡によるアポトーシス死によって評価されました。' - トリホスホン酸 - ビオチンニックエンド標識（TUNEL）陽性細胞、および細胞内断面の免疫ブロッティングによるポリ（ADPリボース）ポリメラーゼ-1（PARP-1）のアポトーシス誘導因子（AIF）および切断の核移行。HBMEC生存率の減少は、低酸素症の総持続時間ではなく、HX/ROサイクルの数に比例しました。介在する正常酸素ROの1時間の1時間HXの4サイクルを使用して、細胞生存率は12〜48時間の間で30％から40％減少しました。in辱中のPARP-1阻害剤3-アミノベンズアミドまたは4-アミノ-1,8-ナフタリミドによる治療により、s辱後24時間でHBMECの生存率が向上し、in辱後16時間での16時間でのTUNEL陽性の用量依存性の低下をもたらしましたが、これらの治療が4時間遅れた場合ではありません。HX/ROによるAIF転座の増加、およびPARP-1の切断も、阻害剤によるin辱の4時間後に用量依存的に減少しました。カスパーゼ阻害剤Z-VAD-FMKはPARP-1切断をブロックしましたが、AIFの転座には影響せず、控えめに細胞保護的でした。これらの発見は、PARP-1の活性化とAIFのPARP-1依存性のカスパーゼ非依存性の核移行が、虚血症再灌流後のアポトーシス脳内皮細胞死に寄与し、PARP活性化を阻害したりAIFPを阻害したり、AIFPを予防することによる虚血微小血管保護の可能性を強調していることを示しています。転座。

Cerebral ischemia-reperfusion leads to vascular dysfunction characterized by endothelial cell injury or death. In the present study, we used an in vitro model to elucidate mechanisms of human brain microvascular endothelial cell (HBMEC) injury after episodic ischemia-reperfusion. Near-confluent HBMEC cultures were exposed to intermittent hypoxia-reoxygenation (HX/RO) and, at different recovery time points, cell viability was assessed by the MTT assay, apoptotic death by fluorescence microscopy of terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated 2'-deoxyuridine 5'-triphosphate-biotin nick end labeling (TUNEL)-positive cells, and nuclear translocation of apoptosis-inducing factor (AIF) and cleavage of poly(ADP-ribose) polymerase-1 (PARP-1) by immunoblotting of subcellular fractions. Reductions in HBMEC viability were proportional to the number of HX/RO cycles, and not the total duration of hypoxia. Using four cycles of 1-h HX with 1 h of intervening normoxic RO, cell viability was reduced 30% to 40% between 12 and 48 h. Treatment with the PARP-1 inhibitors 3-aminobenzamide or 4-amino-1,8-naphthalimide during the insult improved HBMEC viability at 24 h after insult, and resulted in dose-dependent reductions in TUNEL-positivity at 16 h after insult, but not if these treatments were delayed by 4 h. HX/RO-induced increases in nuclear AIF translocation, as well as PARP-1 cleavage, were also reduced dose-dependently at 4 h after insult by the inhibitors. The caspase inhibitor z-VAD-fmk blocked PARP-1 cleavage, but did not affect AIF translocation and was only modestly cytoprotective. These findings indicate that PARP-1 activation and a PARP-1-dependent, caspase-independent, nuclear translocation of AIF contribute to apoptotic cerebral endothelial cell death after ischemia-reperfusion, underscoring the potential for ischemic microvascular protection by inhibiting PARP activation or preventing AIF translocation.