親油性MAPK経路タンパク質の遺伝子の移植後致死ノックアウトは、移植前のマウス胚と栄養芽細胞幹細胞で発現しています

マイトジェン活性化プロテインキナーゼ（MAPK）シグナル伝達経路は、胚の増殖と分化を制御する上で重要な役割を果たします。MAPK経路に参加する連続性親油性シグナル伝達メディエーターは、腫瘍後致死性であることが実証されています。これらのヌル変異体の致死性が移植後に発生する理由は明らかではありません。1つの仮説は、これらの移植後の致死ヌル変異体の遺伝子産物は、正常な胚に移植する前に存在せず、着床後まで機能を持たないということです。この仮説をテストするために、ヌル変異体が初期の移植または胎盤致死をもたらすMAPKシグナル伝達経路を媒介する親油性遺伝子のセットを選択しました。これらには、FRS2ALPHA、GAB1、GRB2、SOS1、RAF-B、およびRAF1が含まれていました。これらの選択された遺伝子の産物が検出され、その位置と機能は、間接的な免疫細胞化学と、mRNA転写のためのタンパク質のウエスタンブロッティングおよびRT-ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）によって示されました。ここでは、6つのシグナルメディエーターすべてが、移植前のマウス胚、胎盤栄養芽層、および培養栄養膜幹細胞（TSC）でタンパク質レベルで検出されることを報告します。タンパク質はすべて、最初に既知のマイトジェン性細胞間コミュニケーションが文書化された時点で、E3.5胚ですべて検出されます。移植後2つのヌル変異遺伝子のmRNA転写産物は、マウスの移植前胚と未浸透性の卵で発現します。これらのmRNA転写産物は、ヌル変異体の致死性を遅らせる可能性のある未受精卵の母体mRNAとして検出されました。すべてのタンパク質は、細胞質または細胞膜で検出されました。空間的および時間的発現のこの研究により、MAPK経路におけるこれらの6つのヌル変異体後の移植後遺伝子はすべて発現し、テストされた場合、胚盤胞でリン酸化/活性化タンパク質が検出されることが明らかになりました。RT-PCRを使用したRNA発現に関する研究は、母体RNAがヌル変異の致死表現型の存在を遅らせる上で重要な役割を果たすことができることを示唆しています。

Mitogen-activated protein kinase (MAPK) signaling pathways play an important role in controlling embryonic proliferation and differentiation. It has been demonstrated that sequential lipophilic signal transduction mediators that participate in the MAPK pathway are null post-implantation lethal. It is not clear why the lethality of these null mutants arises after implantation and not before. One hypothesis is that the gene product of these post-implantation lethal null mutants are not present before implantation in normal embryos and do not have function until after implantation. To test this hypothesis, we selected a set of lipophilic genes mediating MAPK signal transduction pathways whose null mutants result in early peri-implantation or placental lethality. These included FRS2alpha, GAB1, GRB2, SOS1, Raf-B, and Raf1. Products of these selected genes were detected and their locations and functions indicated by indirect immunocytochemistry and Western blotting for proteins and RT-polymerase chain reaction (PCR) for mRNA transcription. We report here that all six signal mediators are detected at the protein level in preimplantation mouse embryo, placental trophoblasts, and in cultured trophoblast stem cells (TSC). Proteins are all detected in E3.5 embryos at a time when the first known mitogenic intercellular communication has been documented. mRNA transcripts of two post-implantation null mutant genes are expressed in mouse preimplantation embryos and unfertilized eggs. These mRNA transcripts were detected as maternal mRNA in unfertilized eggs that could delay the lethality of null mutants. All of the proteins were detected in the cytoplasm or in the cell membrane. This study of spatial and temporal expression revealed that all of these six null mutants post-implantation genes in MAPK pathway are expressed and, where tested, phosphorylated/activated proteins are detected in the blastocyst. Studies on RNA expression using RT-PCR suggest that maternal RNA could play an important role in delaying the presence of the lethal phenotype of null mutations.