Sphingomonas paucimobilis ut26からのハロアルカンデハロゲナーゼリンブの基質特異性の定量分析

ハロアルカン デハロゲナーゼは、ハロゲン化化合物の炭素 - ハロゲン結合を切断する微生物の酵素です。スフィンゴモナス パウシモビリス UT26 から単離されたハロアルカン デハロゲナーゼ LinB は、広範な特異性をもつ酵素です。55 種類のハロゲン化脂肪族および環状炭化水素を、LinB 酵素による脱ハロゲン化についてテストしました。試験用の化合物は、統計的実験計画を使用して体系的に選択されました。酵素による検出可能な切断と低い非生物的加水分解を示した 25 の基質について、定常状態の速度定数 K(m) および k(cat) を決定しました。古典的な定量的構造活性相関 (QSAR) を使用して、速度定数と分子記述子を相関させ、実験データの変動性の 94% を説明するモデルが得られました。このハロアルカン デハロゲナーゼに対する試験した基質の結合親和性は、疎水性、分子表面、双極子モーメント、および体積:表面比と相関していました。LinB の活性部位ポケットにおける基質分子の結合は、分子のサイズに非線形に依存します。結合親和性は、炭素原子の鎖長が 6 個になるまでは基質のサイズが大きくなるにつれて増加し、その後減少します。次に、比較結合エネルギー (COMBINE) 分析を使用して、基質特異性を調節する LinB 内のアミノ酸残基を同定しました。統計的に有意な 3 つの主成分を含むモデルにより、実験データの変動性の 95% が説明されました。古典的な QSAR モデルにおける基質サイズの重要性と一致して、基質分子と酵素の間のファンデルワールス相互作用が COMBINE モデルを支配しました。限られた数のタンパク質残基 (6 ～ 8%) のみが、結合親和性の変動の説明に大きく寄与します。結合親和性の変動を説明するために重要なアミノ酸残基は次のとおりです: (i) 第一シェル残基 Asn38、Asp108、Trp109、Glu132、Ile134、Phe143、Phe151、Phe169、Val173、Trp207、Pro208、Ile211、Leu248、および His272(ii) トンネル残基 Pro144、Asp147、Leu177、および Ala247、および (iii) 第 2 シェル残基 Pro39 および Phe273。トンネルおよび第 2 シェル残基は、それらの置換によって活性部位の構造が破壊されて機能が失われることがないため、特異性を調節するための最良の標的となります。異なる特異性への分子適応のメカニズムを、2 つのタンパク質ファミリー メンバーについて導出されたモデルの定量的比較に基づいて議論します。

Haloalkane dehalogenases are microbial enzymes that cleave a carbon-halogen bond in halogenated compounds. The haloalkane dehalogenase LinB, isolated from Sphingomonas paucimobilis UT26, is a broad-specificity enzyme. Fifty-five halogenated aliphatic and cyclic hydrocarbons were tested for dehalogenation with the LinB enzyme. The compounds for testing were systematically selected using a statistical experimental design. Steady-state kinetic constants K(m) and k(cat) were determined for 25 substrates that showed detectable cleavage by the enzyme and low abiotic hydrolysis. Classical quantitative structure-activity relationships (QSARs) were used to correlate the kinetic constants with molecular descriptors and resulted in a model that explained 94% of the experimental data variability. The binding affinity of the tested substrates for this haloalkane dehalogenase correlated with hydrophobicity, molecular surface, dipole moment, and volume:surface ratio. Binding of the substrate molecules in the active site pocket of LinB depends nonlinearly on the size of the molecules. Binding affinity increases with increasing substrate size up to a chain length of six carbon atoms and then decreases. Comparative binding energy (COMBINE) analysis was then used to identify amino acid residues in LinB that modulate its substrate specificity. A model with three statistically significant principal components explained 95% of the experimental data variability. van der Waals interactions between substrate molecules and the enzyme dominated the COMBINE model, in agreement with the importance of substrate size in the classical QSAR model. Only a limited number of protein residues (6-8%) contribute significantly to the explanation of variability in binding affinities. The amino acid residues important for explaining variability in binding affinities are as follows: (i) first-shell residues Asn38, Asp108, Trp109, Glu132, Ile134, Phe143, Phe151, Phe169, Val173, Trp207, Pro208, Ile211, Leu248, and His272, (ii) tunnel residues Pro144, Asp147, Leu177, and Ala247, and (iii) second-shell residues Pro39 and Phe273. The tunnel and the second-shell residues represent the best targets for modulating specificity since their replacement does not lead to loss of functionality by disruption of the active site architecture. The mechanism of molecular adaptation toward a different specificity is discussed on the basis of quantitative comparison of models derived for two protein family members.