3つの異なる種における相補的なDNA減算とマイクロアレイ分析を使用した新規および既知の卵母細胞特異的遺伝子の同定

本研究の主な目的は、ウシ、マウス、アフリカアキュニアレヴィスの3つの異なる種の新しい卵母細胞特異的遺伝子を特定することでした。この目標を達成するために、2つの強力な技術が組み合わされました：ポリメラーゼ連鎖反応（PCR）ベースのcDNA減算とcDNAマイクロアレイ。3456クローンで構成される3つの減算ライブラリが確立され、卵母細胞特異的転写産物のために濃縮されました。正の挿入含有クローンのシーケンス分析により、次の分類が生じました。クローンの53％は既知のcDNAに対応し、26％が特徴づけられていないcDNAとして分類され、最終9％が新規シーケンスとして分類されました。これらすべてのクローンは、cDNAマイクロアレイの準備に使用されました。これらのマイクロアレイ分析の結果は、GDF9、BMP15、ZPなどのすでに既知の卵母細胞特異的遺伝子に加えて、卵母細胞に機能が不明な遺伝子がMLF1相互作用タンパク質（MLF1IP）、B-などを同定したことが明らかになりました。細胞転座遺伝子4（BTG4）、およびホスホチロシン結合タンパク質（XPTB）。さらに、15の新規卵母細胞特異的遺伝子は、体性組織と比較して卵母細胞での優先的な発現を確認するために、逆転写PCRによって検証されました。本研究で得られた結果は、マイクロアレイ分析が抑制的な減算ハイブリダイゼーション実験から真の陽性を特定するための堅牢な手法であることを確認しました。さらに、3つの種から卵母細胞特異的遺伝子を同時に得ることで、種全体で保存されている重要な遺伝子を見ることができました。これらの新規卵母細胞特異的遺伝子のさらなる特性評価は、卵母細胞に見られるユニークな機能に関連する分子メカニズムのより良い理解につながります。

The main objective of the present study was to identify novel oocyte-specific genes in three different species: bovine, mouse, and Xenopus laevis. To achieve this goal, two powerful technologies were combined: a polymerase chain reaction (PCR)-based cDNA subtraction, and cDNA microarrays. Three subtractive libraries consisting of 3456 clones were established and enriched for oocyte-specific transcripts. Sequencing analysis of the positive insert-containing clones resulted in the following classification: 53% of the clones corresponded to known cDNAs, 26% were classified as uncharacterized cDNAs, and a final 9% were classified as novel sequences. All these clones were used for cDNA microarray preparation. Results from these microarray analyses revealed that in addition to already known oocyte-specific genes, such as GDF9, BMP15, and ZP, known genes with unknown function in the oocyte were identified, such as a MLF1-interacting protein (MLF1IP), B-cell translocation gene 4 (BTG4), and phosphotyrosine-binding protein (xPTB). Furthermore, 15 novel oocyte-specific genes were validated by reverse transcription-PCR to confirm their preferential expression in the oocyte compared to somatic tissues. The results obtained in the present study confirmed that microarray analysis is a robust technique to identify true positives from the suppressive subtractive hybridization experiment. Furthermore, obtaining oocyte-specific genes from three species simultaneously allowed us to look at important genes that are conserved across species. Further characterization of these novel oocyte-specific genes will lead to a better understanding of the molecular mechanisms related to the unique functions found in the oocyte.