蛍光分光法を使用して、凝集体、プレフィブリルアミロイド形成オリゴマー、およびプロトフィブリルの検出と特性評価

トランスサイレチン（TTR）は、老化した全身性アミロイドーシスや家族性アミロイド症の多発性多発性症を含む多くの異なるアミロイド疾患に関連するタンパク質です。後にフィブリラー凝集体に成熟した誤って折り畳まれたTTRのオリゴマー中間体の一時的な性質は、研究が困難であり、これらの種を研究する方法はまばらです。この作業では、TTRのプレフィブリラー凝集体の生成のための新しい経路を探ります。これは、TTRの誤って折り畳みに関する重要な洞察を提供します。筋肉折りたたTTRのプレミブリルアミロイド形成オリゴマーとプロトフィブリルは、NaClの添加を通じて、酸拡散TTRからの溶融球体型A状態の誘導を通じてin vitroで生成されました。凝集プロセスは、2時間以内にかなり単分散オリゴマー（300〜500 kd）を生成し、20時間後に透過型電子顕微鏡で示されるように、20時間後に大きな球状クラスター（直径30〜50 nm）とプロトフィブリルに成熟しました。凝集体のさらなる成熟により、フィブリルの長さが成長するにつれて球体の収縮が示され、球体の立体構造変化がより硬い構造への変化を示唆しました。凝集体の構造的および物理化学的特性は、蛍光、円形二色性、化学架橋、および透過型電子顕微鏡を使用して調査されました。蛍光色素1-アニリノナフタレン-8-スルホネート（ANS）、4-4-ビス-1-フェニルアミノ-8-ナフタレンスルホネート（Bis-ANS）、4-（ジチアノビニル） - ジュロリジン（DCVJ）、およびThioflavin T（tht（thtt（tht）））静的状態と時間分解蛍光技術の両方を使用して、これらのオリゴマーおよびプロトフィブリル状態を特徴付ける静的アッセイと速度論的アッセイの両方で使用されました。分子ローターであるDCVJは、アミロイド形成プロセスの研究に初めて採用され、オリゴマー化プロセスの初期段階の検出に役立つことが示されています。DCVJは、初期のプレリブリラーオリゴマー（300〜500 kd）に結合し、見かけの解離定数が1.6マムで、これはTHT（6.8マム）よりもわずかに優れていました。ANSの時間分解蛍光異方性崩壊は、オリゴマー凝集体のさらなる構造的および速度論的情報を提供するための有用なツールであることが示されました。アミロイドフィブリルに結合すると、蛍光量子収量を劇的に増加させます。ただし、このプロパティの背後にあるメカニズムは不明です。この作業のデータは、アンバウンドTHTが本質的に消光され、分子ローターと同様に機能が同様に機能していることを示唆しています。これは、その環境依存と組み合わせて、アミロイド線維に結合したときに特徴的な482 nm波長に青いシフトを提供します。

Transthyretin (TTR) is a protein linked to a number of different amyloid diseases including senile systemic amyloidosis and familial amyloidotic polyneuropathy. The transient nature of oligomeric intermediates of misfolded TTR that later mature into fibrillar aggregates makes them hard to study, and methods to study these species are sparse. In this work we explore a novel pathway for generation of prefibrillar aggregates of TTR, which provides important insight into TTR misfolding. Prefibrillar amyloidogenic oligomers and protofibrils of misfolded TTR were generated in vitro through induction of the molten globule type A-state from acid unfolded TTR through the addition of NaCl. The aggregation process produced fairly monodisperse oligomers (300-500 kD) within 2 h that matured after 20 h into larger spherical clusters (30-50 nm in diameter) and protofibrils as shown by transmission electron microscopy. Further maturation of the aggregates showed shrinkage of the spheres as the fibrils grew in length, suggesting a conformational change of the spheres into more rigid structures. The structural and physicochemical characteristics of the aggregates were investigated using fluorescence, circular dichroism, chemical cross-linking, and transmission electron microscopy. The fluorescent dyes 1-anilinonaphthalene-8-sulfonate (ANS), 4-4-bis-1-phenylamino-8-naphthalene sulfonate (Bis-ANS), 4-(dicyanovinyl)-julolidine (DCVJ), and thioflavin T (ThT) were employed in both static and kinetic assays to characterize these oligomeric and protofibrillar states using both steady-state and time-resolved fluorescence techniques. DCVJ, a molecular rotor, was employed for the first time for studies of an amyloidogenic process and is shown useful for detection of the early steps of the oligomerization process. DCVJ bound to the early prefibrillar oligomers (300-500 kD) with an apparent dissociation constant of 1.6 muM, which was slightly better than for ThT (6.8 muM). Time-resolved fluorescence anisotropy decay of ANS was shown to be a useful tool for giving further structural and kinetic information of the oligomeric aggregates. ThT dramatically increases its fluorescence quantum yield when bound to amyloid fibrils; however, the mechanism behind this property is unknown. Data from this work suggest that unbound ThT is also intrinsically quenched and functions similarly to a molecular rotor, which in combination with its environmental dependence provides a blue shift to the characteristic 482 nm wavelength when bound to amyloid fibrils.