ネイティブおよび脱グリコシル化ハイブリッドアスペン（Populus tremulaxtremuloides）の酵素特性キシログルカンエンドランスグリコシラーゼ16a pichia pastorisで発現した

Xyloglucan EndotransglycosylaseをコードするcDNA、Pttxet16a、ハイブリッドアスペン（Populus tremulaxtremuloides）からのcDNAは、発現したシーケンスタグライブラリから分離され、メチロトフィック酵母ピチア牧師で発現しています。配列分析では、GH16のXTH（キシログルカントランスグリコシラーゼ/ヒドロラーゼ）遺伝子サブファミリー（グリコシドヒドロラーゼファミリー16）の他のタンパク質との高度な類似性が示されました。保存されたGH16触媒配列モチーフに加えて、PTTXET16Aには、予測された触媒残基の近位に位置する保存されたN-グリコシル化部位が含まれています。MS分析は、P。pastorisで発現した組換えPTTXET16Aは、可変n-グリコシル化の存在とαファクター分泌シグナルペプチドの不完全な切断のために不均一であることを示しました。エンドグリコシダーゼH処理によるN-グリカンの除去は、触媒活性に大きな影響を与えませんでした。同様に、N-グリコシル化部位を除去するためのSN93のSN93の部位指向突然変異誘発は、特定の活性と熱安定性における野生型酵素に匹敵するが、溶解度が明らかに低下した酵素をもたらしました。加水分解活性は、酵素性脱グリコシル化の前または後の野生型PTTXET16Aでも、PTTXET16A N93S（ASN93-> Ser）変異体でも検出されませんでした。

The cDNA encoding a xyloglucan endotransglycosylase, PttXET16A, from hybrid aspen (Populus tremulaxtremuloides) has been isolated from an expressed sequence tag library and expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris. Sequence analysis indicated a high degree of similarity with other proteins in the XTH (xyloglucan transglycosylase/hydrolase) gene subfamily of GH16 (glycoside hydrolase family 16). In addition to the conserved GH16 catalytic sequence motif, PttXET16A contains a conserved N-glycosylation site situated proximal to the predicted catalytic residues. MS analysis indicated that the recombinant PttXET16A expressed in P. pastoris is heterogeneous due to the presence of variable N-glycosylation and incomplete cleavage of the alpha-factor secretion signal peptide. Removal of the N-glycan by endoglycosidase H treatment did not influence the catalytic activity significantly. Similarly, site-directed mutagenesis of Asn93 to serine to remove the N-glycosylation site resulted in an enzyme which was comparable with the wild-type enzyme in specific activity and thermal stability but had clearly reduced solubility. Hydrolytic activity was detected neither in wild-type PttXET16A before or after enzymatic deglycosylation nor in PttXET16A N93S (Asn93-->Ser) mutant.