Neospora caninum：リアルタイムPCRを使用して、自然に感染した中止および妊娠中の牛の血液中のDNAの定量化

この研究では、妊娠中の血液および脳のネオスポラカニヌムDNAを定量化し、二本鎖DNA結合染料であるSybr Green Iを使用してPCR産物形成をリアルタイムで監視することにより、未経産牛を定量化しました。プライマーは、N。caninumのNC-5遺伝子フラグメントからN. caninumに固有の188 bp製品を増幅するように設計されています。同様に、コントロールとして機能するウシゲノムDNAの28S RRNA遺伝子から71 bp産物が増幅されました。アガロースゲル電気泳動とPCR産物の融解曲線の分析により、両方のプライマーペアが標的に特異的であることが示されました。標準曲線は、ウシとN. caninumゲノムDNAの両方に対して生成され、テストサンプルのウシDNAに対する寄生虫の相対濃度を計算するために使用されました。血液から得られた1 ngのウシゲノムDNAのN. caninum DNAの濃度は、観察の第1週に0.097 ng、15週目の中止牛で0 ngの範囲でした。妊娠中の牛では、値は1週目に0.080 ngから観察の15週目の0.155 ngの範囲でした。妊娠中絶後の中止群では、DNA濃度が持続的に減少し、妊娠群でDNA濃度が増加しました。感染した未経産牛の血液および脳の寄生虫DNAの比較は、血液よりも脳のDNA濃度が高いことを示しました。この研究は、N。caninumDNAを定量化して、血液中のゲノムDNAを宿すために寄生虫DNAの相対濃度を得ることができることを示しています。この手法により、一度に多数のサンプルをテストすることができ、検査済みの動物の虐殺を必要とせずに行うことができます。

This study quantified Neospora caninum DNA in the blood and brain of pregnant and aborted heifers by monitoring PCR product formation in real-time using SYBR Green I, a double-stranded DNA-binding dye. Primers were designed to amplify a 188 bp product specific to N. caninum from the Nc-5 gene fragment of N. caninum. Similarly, a 71 bp product was amplified from the 28S rRNA gene of bovine genomic DNA that served as a control. Agarose gel electrophoresis and analysis of the melting curve for PCR products showed that both primer pairs were specific to their targets. Standard curves were generated for both bovine and N. caninum genomic DNA, and were used to compute the relative concentration of parasite to bovine DNA in the test samples. The concentration of N. caninum DNA in 1 ng of bovine genomic DNA obtained from blood ranged between 0.097 ng at the 1st week of the observation and 0 ng at the 15th week in aborted cows. In pregnant cows, the values ranged between 0.080 ng at the 1st week and 0.155 ng at the 15th week of observation. There was a sustained decrease of DNA concentration in the aborted group after abortion and an increase in DNA concentration in the pregnant group. Comparison of parasite DNA in blood and brain of infected heifers showed a higher DNA concentration in brain than in blood. This study shows that N. caninum DNA can be quantified to obtain the relative concentration of parasite DNA to host genomic DNA in blood. This technique allows testing of a large number of samples at one time and can be done without the need for slaughter of tested animals.