セラミドは脂質ラフトからコレステロールを変位させ、コレステロール結合タンパク質カベオリン-1の関連を減少させます

外因性セラミドを添加すると、脂質ラフトモデル膜にコレステロールが大幅に変位します。しかし、セラミド誘発コレステロール変位がカベオリン濃縮脂質ラフト膜のタンパク質組成を変化させるのに十分であるかどうかは不明です。したがって、細菌性スフィンゴミエリナーゼ（BSMase）を枯渇させたコレステロールを枯渇させ、不滅のシュワン細胞から分離したカベオリン濃縮膜（CEM）のタンパク質組成を変化させ、内因性セラミドレベルを増加させるかどうかを調べました。BSMaseはセラミドレベルを数倍に増加させ、2時間以内に界面活性剤加工性CEMのコレステロール含有量を25〜50％減少させました。CEMのタンパク質組成に対するセラミドの効果を調べるために、培養およびマトリックス支援レーザー脱着イオン化時間分光法における細胞の安定した同位体標識を使用して、定量的プロテオーム解析を実行しました。セラミドは急速に脂質ラフトコレステロールを枯渇させましたが、コレステロール結合タンパク質カベオリン-1（CAV-1）のレベルは8時間後にのみ25％減少しました。重要なことに、コレステロールで細胞を補充すると、CAV-1の喪失がCEMSから急速に逆転したことです。セラミド誘発コレステロールの枯渇は、5'-ヌクレオチダーゼとATPシンターゼベータサブユニットとCEMSの関連を増加させましたが、フロチリン-1やGタンパク質などの他の脂質ラフトタンパク質の存在量の変化に最小限の影響を及ぼしました。これらの結果は、CEMからのセラミド誘発コレステロールの損失が脂質ラフトプロテオームの変化に寄与する可能性があることを示唆しています。

Addition of exogenous ceramide causes a significant displacement of cholesterol in lipid raft model membranes. However, whether ceramide-induced cholesterol displacement is sufficient to alter the protein composition of caveolin-enriched lipid raft membranes is unknown. Therefore, we examined whether increasing endogenous ceramide levels with bacterial sphingomyelinase (bSMase) depleted cholesterol and changed the protein composition of caveolin-enriched membranes (CEMs) isolated from immortalized Schwann cells. bSMase increased ceramide levels severalfold and decreased the cholesterol content of detergent-insoluble CEMs by 25-50% within 2 h. To examine the effect of ceramide on the protein composition of the CEMs, we performed a quantitative proteomic analysis using stable isotope labeling of cells in culture and matrix-assisted laser desorption ionization time-of-flight mass spectrometry. Although ceramide rapidly depleted lipid raft cholesterol, the levels of the cholesterol binding protein caveolin-1 (Cav-1) decreased by 25% only after 8 h. Importantly, replenishing the cells with cholesterol rapidly reversed the loss of Cav-1 from the CEMs. Ceramide-induced cholesterol depletion increased the association of 5'-nucleotidase and ATP synthase beta-subunit with the CEMs but had a minimal effect on changing the abundance of other lipid raft proteins, such as flotillin-1 and G-proteins. These results suggest that the ceramide-induced loss of cholesterol from CEMs may contribute to altering the lipid raft proteome.