Bacillus subtilis W23キシロース利用オペロンの調節：XylリプレッサーとXyl演算子および誘導性キシロースとの相互作用

Bacillus subtilis W23の粗タンパク質抽出物には、ゲルモビリティシフトアッセイで検出されたXyl演算子の配列特異的DNA結合活性が含まれています。マルチコピープラスミドにコードされたXylr決定要因は、この結合活性の発現の増加につながります。ポリアクリルアミドゲルにおけるタンパク質DNA複合体のin situフットプリント分析は、Xyl演算子が各鎖の26個のリン酸エステル結合で銅 - フェナントロリンによる切断から配列特異的に結合され、保護されていることを示しています。リプレッサー結合のための定量的競合アッセイでは、ポリリンカーにクローン化された25 bpの合成Xylオペレーターが、野生型キシル調節領域のオペレーターと同じ親和性で結合していることが明らかになりました。これにより、野生型シーケンスの追加部位がリプレッサーの結合に寄与していないことが確認されています。Xyl演算子は、5つの中央非パリンドロミック塩基ペアに隣接する10個のパリンドローム塩基対で構成されています。突然変異解析では、中心塩基対の配列がリプレッサータンパク質による認識に寄与し、パリンドローム要素の間隔がリプレッサー結合に重要であることを示しています。オペレーターの半分のサイトは、リプレッサーに拘束されません。in vivoおよびin vitro誘導研究は、いくつかの構造的に類似した糖のうち、キシロースがXylリプレッサーの唯一の分子誘導者であることを示唆しています。

A crude protein extract of Bacillus subtilis W23 contains a sequence-specific DNA binding activity for the xyl operator as detected by the gel mobility shift assay. A xylR determinant encoded on a multicopy plasmid leads to increased expression of this binding activity. In situ footprinting analysis of the protein-DNA complex in a polyacrylamide gel shows that the xyl operator is sequence-specifically bound and protected from cleavage by copper-phenanthroline at 26 phosphodiester bonds on each strand. Quantitative competition assays for repressor binding reveal that a 25 bp synthetic xyl operator cloned into a polylinker is bound with the same affinity as the operator in the wild-type xyl regulatory region. This confirms that no additional sites in the wild-type sequence contribute to repressor binding. The xyl operator consists of ten palindromic base pairs flanking five central non-palindromic base pairs. A mutational analysis shows that the sequence of the central base pairs contributes to recognition by the repressor protein and that the spacing of the palindromic elements is crucial for repressor binding. An operator half site is not bound by the repressor. In vivo and in vitro induction studies suggest that, of several structurally similar sugars, xylose is the only molecular inducer of the Xyl repressor.