パイロシーケンシングを使用して、異なるヒト組織および細胞におけるGタンパク質ガルファスサブユニットスプライスバリアントの定量化

Gタンパク質ガルファスは、4つの長いバリエーション（ガルファス（L）+CAGおよびガルファス（L）-CAG）の4つの代替のスプレッチ転写産物（追加の45 bpセグメントを含む）に由来し、2つの短いバリエーション（ガルファ（S）+CAGおよびGALPHAS -CAG）。長い形態と短い形態は、さまざまなエクソン3の3 '末端にコードされたセリン残基の内外でスプライシングすることによって異なります。ヒト組織の4つのバリアントすべての相対的な発現は、実験的な制限のために十分に調査されていません。したがって、私たちは、パイロシーケンス技術に基づいてこれらのスプライスバリアントの信頼できる相対mRNA定量化、およびさまざまなヒト組織および細胞のガルファス転写比を決定する方法を確立しました。ガルファス/ガルファス比は、血液単核細胞（0.84 +/- 0.02、n = 16）で最も高く、脳で最も低かった（0.51 +/- 0.14、n = 3）。異なる範囲は、ガルファス +CAG比の違いから生じました。これは、心臓組織の0.32 +/- 0.07（n = 12）の総ガルファス比から、血液単核の0.57 +/- 0.03（n = 16）の範囲でした。細胞（P <0.0001）、ガルファス（S）キャッグ比はかなり一定であり、網膜芽細胞腫細胞の0.22 +/- 0.04（n = 7）からリンパ球の0.27 +/- 0.04（p = 0.19）の範囲でした。ガルファス（L） +CAG比は、心臓組織の0.02 +/- 0.02から網膜芽細胞腫細胞の0.05 +/- 0.01の範囲であり、Galphas（L）-CAGの割合がさまざまで、血液中の0.14 +/- 0.02から0.14 +/- 0.02の範囲でした。心臓組織の0.41 +/- 0.08への単核細胞。イソプロテレノールを使用した不死化Bリンパ芽球の刺激は、スプライスバリアント比の有意な変化をもたらしました。私たちのデータは、異なる組織におけるガルファの長い比率と短い比の変化が、ガルファス（L）+CAGおよびガルファス（S-）CAGではなく、ガルファス（L）-CAGおよびガス+CAGに影響を与えたことを示しています。さらに、細胞の刺激は、スプライスバリアント比に影響を与えるように見えました。したがって、これらの結果は、これらのバリアントのさまざまな生物学的機能を示唆しています。

The G protein Galphas is derived from four alternatively spliced transcripts, two long variants (Galphas(L)+CAG and Galphas(L)-CAG), which include an extra 45-bp segment, and two short variants (Galphas(S)+CAG and Galphas(S)-CAG). The long and short forms differ in each case by splicing in or out of a serine residue encoded at the 3' end of the variable exon 3. The relative expression of all four variants in human tissues is poorly investigated due to experimental limitations. We therefore established a method for reliable relative mRNA quantification of these splice variants based on the Pyrosequencing technology, and determined Galphas transcript ratios in various human tissues and cells. Galphas(S)/Galphas ratio was highest in blood mononuclear cells (0.84 +/- 0.02, n = 16) and lowest in the brain (0.51 +/- 0.14, n = 3). The different ranges resulted from differences in Galphas(S)+CAG ratios, which ranged from a total Galphas ratio of 0.32 +/- 0.07 (n = 12) in heart tissue to 0.57 +/- 0.03 (n = 16) in blood mononuclear cells (p < 0.0001), whereas the Galphas(S)-CAG ratio was rather constant and ranged from 0.22 +/- 0.04 (n = 7) in retinoblastoma cells to 0.27 +/- 0.04 in lymphocytes (p = 0.19). The Galphas(L)+CAG ratio ranged from 0.02 +/- 0.02 in heart tissue to 0.05 +/- 0.01 in retinoblastoma cells, with a varying proportion of Galphas(L)-CAG, which ranged from 0.14 +/- 0.02 in blood mononuclear cells to 0.41 +/- 0.08 in heart tissue. Stimulation of immortalized B lymphoblasts with isoproterenol resulted in significant changes of splice variant ratios. Our data indicate that changes of long and short ratios of Galphas in different tissues affected Galphas(L)-CAG and Gas(S)+CAG rather than Galphas(L)+CAG and Galphas(S-)CAG. Furthermore, stimulation of cells seemed to affect splice variant ratios. These results are, therefore, suggestive of different biological functions of these variants.