ゲンタマイシンの細胞質および核内結合は、エンドサイトーシスを必要としません

耳毒性および腎毒性のアミノグリコシド抗生物質が細胞を浸透させる細胞メカニズム、およびこれらの分子の正確な細胞内分布を理解することで、アミノグリコシド感受性標的の同定、および潜在的な取り込み遮断者が可能になります。OKとMDCKの2つの腎細胞株のクローンを、テキサスレッド（GTTR）に関連するアミノグリコシドゲンタマイシンで処理しました。以前の報告のように、エンドソームの蓄積は生細胞、またはホルムアルデヒドのみで固定された細胞で観察されました。しかし、固定細胞の剥離により、細胞質および核コンパートメントのGTTR蛍光が明らかになりました。GTTRと非共役ゲンタマイシンの両方の免疫標識は、GTTR蛍光の細胞質分布に対応していました。核内GTTR結合は、核小体および核横断尿細管の標識RNAと共局在しています。GTTRの細胞質および核分布は、ゲンタマイシンの既知のリガンドであるホスファチジルイノシトール - ビスリン酸（PIP2）によって消光されました。細胞質および核GTTR結合は、時間の経過とともに（37度Cで、または氷上でエンドサイトーシスを阻害する）増加し、非共役ゲンタマイシン、つまりGTTR結合の濃度を増加させることで連続的に競合しました。対照的に、細胞を最大4 mg/mLの非共役ゲンタマイシンと共インキュベートした場合、エンドサイトーシスGTTR取り込みの減少はほとんどまたはまったく減少しました。したがって、細胞質および核GTTRの取り込みは時間依存性、弱い温度依存性、および飽和性であり、エンドソーム非依存性メカニズムを介して発生し、細胞へのゲントマイシン侵入の生物摂取ルートとしての血漿膜のイオンチャネル、トランスポーターまたは孔を含むことを示唆しています。

Understanding the cellular mechanism(s) by which the oto- and nephrotoxic aminoglycoside antibiotics penetrate cells, and the precise intracellular distribution of these molecules, will enable identification of aminoglycoside-sensitive targets, and potential uptake blockers. Clones of two kidney cell lines, OK and MDCK, were treated with the aminoglycoside gentamicin linked to the fluorophore Texas Red (GTTR). As in earlier reports, endosomal accumulation was observed in live cells, or cells fixed with formaldehyde only. However, delipidation of fixed cells revealed GTTR fluorescence in cytoplasmic and nuclear compartments. Immunolabeling of both GTTR and unconjugated gentamicin corresponded to the cytoplasmic distribution of GTTR fluorescence. Intra-nuclear GTTR binding co-localized with labeled RNA in the nucleoli and trans-nuclear tubules. Cytoplasmic and nuclear distribution of GTTR was quenched by phosphatidylinositol-bisphosphate (PIP2), a known ligand for gentamicin. Cytoplasmic and nuclear GTTR binding increased over time (at 37 degrees C, or on ice to inhibit endocytosis), and was serially competed off by increasing concentrations of unconjugated gentamicin, i.e., GTTR binding is saturable. In contrast, little or no reduction of endocytotic GTTR uptake was observed when cells were co-incubated with up to 4 mg/mL unconjugated gentamicin. Thus, cytoplasmic and nuclear GTTR uptake is time-dependent, weakly temperature-dependent and saturable, suggesting that it occurs via an endosome-independent mechanism, implicating ion channels, transporters or pores in the plasma membrane as bioregulatory routes for gentamicin entry into cells.