ムコイド緑膿菌バイオフィルムの細胞外マトリックスに関連するカルシウム誘発性毒性因子

Pseudomonas aeruginosaは、嚢胞性線維症（CF）の患者の肺組織に定着し、バイオフィルム関連感染症につながります。CF患者の肺液には通常、陽イオンの上昇が含まれており、宿主細胞のカルシウム恒常性を破壊することが知られている緑膿菌酸化物活性色素ピョシアニンを含む場合があります。二重カチオンは細菌多糖類の重要なブリッジングイオンであり、細菌遺伝子発現において調節的役割を果たす可能性があるため、緑膿菌バイオフィルムの細胞外マトリックス成分に対するカルシウムイオンの効果を調査しました。ムコイド株P.緑膿菌FRD1の場合、カルシウム添加（CACL（2）として1.0および10 mm）により、カルシウムを加えないバイオフィルムよりも少なくとも10倍厚いバイオフィルムが得られました。走査型共焦点レーザー顕微鏡検査では、厚いバイオフィルムの細胞間の間隔の増加が示され、フーリエ変換赤外線分光法は、細胞間の材料が主にアルギン酸塩であることを明らかにしました。algd転写レポーターは、カルシウムの添加がFRD1バイオフィルムのALG遺伝子発現の8倍の増加を引き起こしたことを実証しました。カルシウムの添加により、3つの細胞外プロテアーゼ（APRA、LASB、およびPRPL）の量が増加しました。バイオフィルム細胞外材料の免疫ブロットは、APRAがバイオフィルム外細胞マトリックス内に抱えていることを確立しました。推定上の緑膿菌カルモジュリン様タンパク質のAPRA欠失変異と遺伝子の突然変異は、カルシウム誘発バイオフィルム構造に有意に影響しませんでした。2次元ゲル電気泳動は、FRD1バイオフィルムおよびカルシウムが改善した浮遊性培養で、フェナジン生合成タンパク質の量の増加を示しました。分光化学分析により、カルシウムの添加がピオシアニン産生の3〜5倍の増加を引き起こすことが示されました。これらの結果は、カルシウムの添加が、細菌細胞外産物の発現と安定性の増加を通じて、ムコイドP. eruginosaバイオフィルムの構造と細胞外マトリックス組成に影響することを示しています。ムコイドP.緑膿菌のカルシウム誘発性細胞外マトリックスは、主に毒性因子アルギン酸塩で構成されており、細胞外プロテアーゼとおそらくピオシアニンは、細胞カルシウムレベルをさらに破壊する可能性のある生体分子を抱えています。

Pseudomonas aeruginosa colonizes the pulmonary tissue of patients with cystic fibrosis (CF), leading to biofilm-associated infections. The pulmonary fluid of CF patients usually contains elevated concentrations of cations and may contain the P. aeruginosa redox-active pigment pyocyanin, which is known to disrupt calcium homeostasis of host cells. Since divalent cations are important bridging ions for bacterial polysaccharides and since they may play regulatory roles in bacterial gene expression, we investigated the effect of calcium ions on the extracellular matrix constituents of P. aeruginosa biofilms. For mucoid strain P. aeruginosa FRD1, calcium addition (1.0 and 10 mM as CaCl(2)) resulted in biofilms that were at least 10-fold thicker than biofilms without added calcium. Scanning confocal laser microscopy showed increased spacing between cells for the thick biofilms, and Fourier transform infrared spectroscopy revealed that the material between cells is primarily alginate. An algD transcriptional reporter demonstrated that calcium addition caused an eightfold increase in alg gene expression in FRD1 biofilms. Calcium addition also resulted in increased amounts of three extracellular proteases (AprA, LasB, and PrpL). Immunoblots of the biofilm extracellular material established that AprA was harbored within the biofilm extracellular matrix. An aprA deletion mutation and a mutation in gene for a putative P. aeruginosa calmodulin-like protein did not significantly affect calcium-induced biofilm structure. Two-dimensional gel electrophoresis showed increased amounts of phenazine biosynthetic proteins in FRD1 biofilms and in calcium-amended planktonic cultures. Spectrochemical analyses showed that the calcium addition causes a three- to fivefold increase in pyocyanin production. These results demonstrate that calcium addition affects the structure and extracellular matrix composition of mucoid P. aeruginosa biofilms, through increased expression and stability of bacterial extracellular products. The calcium-induced extracellular matrix of mucoid P. aeruginosa consists primarily of the virulence factor alginate and also harbors extracellular proteases and perhaps pyocyanin, a biomolecule that may further disrupt cellular calcium levels.