フェニルケトン尿の酵素置換治療のための構造ベースの化学修飾戦略

化学的修飾（Pegylationなど）と組み合わせた構造ベースのタンパク質エンジニアリングは、治療薬としてのタンパク質の発達を大幅に改善するための強力な組み合わせです。検査症例として、フェニルケトン尿症の酵素補充療法のために、フェニルアラニンアンモニアリアーゼ（PAL、EC 4.3.1.5）を選択しました[C.R.Scriver、S。Kaufman、高フェニルアラニン血症：フェニルアラニンヒドロキシラーゼ欠乏症。遺伝性疾患の代謝および分子塩基、McGraw-Hill、New York、2001、第77章]、遺伝性代謝障害（OMIM 261600）は、酵素L-フェニルアラニンヒドロキシラーゼの欠乏による精神遅滞を引き起こします（EC 1.14.16.1）。組換えPALの以前のin vivo研究では、血液L-フェニルアラニンレベルの低下が示されました。しかし、代謝効果はタンパク質の分解と免疫原性のために持続しませんでした[C.N.Sarkissian、Z。Shao、F。Blain、R。Peevers、H。Su、R。Heft、T.M。Chang、C.R。Scriver、フェニルケトン尿の治療に対する異なるアプローチ：再生フェニルアラニンアンモニアリアーゼによるフェニルアラニン分解、Proc。natl。アカデミー。SCI。USA 96（1999）2339;J.A.ホスキンズ、G。ジャック、H.E。ウェイド、R.J。ペイリス、E.C。ライト、D.J。Starr、J。Stern、フェニルケトン尿におけるフェニルアラニン摂取の酵素制御、Lancet 1（1980）392;CM。Ambrus、S。Anthone、C。Horvath、K。Kalghatgi、A.S。Lele、G。Eapen、J.L。Ambrus、A.J。ライアン、P。Li、フェニルケトン尿症におけるフェニルアラニンの枯渇のための体外酵素反応器、ANN。インターン。医薬品。106（1987）531]。ここでは、ペギル化されたPAL製剤に関するin vitroおよびin vivo PKUマウスモデルの研究だけでなく、構造ベースの分子工学、PALのペギル化、PELのPEGYLATION、PEGYLATION、PALのPEGYLATIONの1.6A 3次元構造を報告します。我々の結果は、R。toruloidesPALのペギー化が、in vivo活性を高め、血漿フェニルアラニンを低下させ、免疫原性の低下をもたらすことにより、皮下注射後の有望な治療効果につながることを示しています。PALの3次元構造は、PKU治療のためのPALのPALのプロパティの特性と、構造ベースのPALリエンジニアリングのための戦略を理解するための基礎を提供します。

Structure-based protein engineering coupled with chemical modifications (e.g., pegylation) is a powerful combination to significantly improve the development of proteins as therapeutic agents. As a test case, phenylalanine ammonia-lyase (PAL, EC 4.3.1.5) was selected for enzyme replacement therapy in phenylketonuria [C.R. Scriver, S. Kaufman, Hyperphenylalaninemia:phenylalanine Hydroxylase Deficiency. The Metabolic and Molecular Bases of Inherited Disease, McGraw-Hill, New York, 2001, Chapter 77], an inherited metabolic disorder (OMIM 261600) causing mental retardation due to deficiency of the enzyme l-phenylalanine hydroxylase (EC 1.14.16.1). Previous in vivo studies of recombinant PAL demonstrated a lowering of blood l-phenylalanine levels; yet, the metabolic effect was not sustained due to protein degradation and immunogenicity [C.N. Sarkissian, Z. Shao, F. Blain, R. Peevers, H. Su, R. Heft, T.M. Chang, C.R. Scriver, A different approach to treatment of phenylketonuria:phenylalanine degradation with recombinant phenylalanine ammonia lyase, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 96 (1999) 2339; J.A. Hoskins, G. Jack, H.E. Wade, R.J. Peiris, E.C. Wright, D.J. Starr, J. Stern, Enzymatic control of phenylalanine intake in phenylketonuria, Lancet 1 (1980) 392; C.M. Ambrus, S. Anthone, C. Horvath, K. Kalghatgi, A.S. Lele, G. Eapen, J.L. Ambrus, A.J. Ryan, P. Li, Extracorporeal enzyme reactors for depletion of phenylalanine in phenylketonuria, Ann. Intern. Med. 106 (1987) 531]. Here, we report the 1.6A three-dimensional structure of Rhodosporidium toruloides PAL, structure-based molecular engineering, pegylation of PAL, as well as in vitro and in vivo PKU mouse model studies on pegylated PAL formulations. Our results show that pegylation of R. toruloides PAL leads to promising therapeutic efficacy after subcutaneous injection by enhancing the in vivo activity, lowering plasma phenylalanine, and leading to reduced immunogenicity. The three-dimensional structure of PAL provides a basis for understanding the properties of pegylated forms of PAL and strategies for structure-based re-engineering of PAL for PKU treatment.