プリンシトシン透過性をコードするFCY2遺伝子の不活性化は、カンジダルシタニアのフルチトシンとフルコナゾールへの交差耐性を促進します

以前の研究では、プリン - シトシン浸透症の欠陥と、カンジダルシタニアの抗真菌性組み合わせフルチトシン（5FC）とフルコナゾール（FLC）に対する交差耐性の獲得との間の可能な関係について説明しました（T.ノエル、F。、P。Paumard、C。Chastin、D。Brethes、およびJ. Villard、Antimicrob。AgentsChemother。47：1275-1284、2003）。縮退したPCRと染色体の歩行を使用して、C。lusitaniaeの2つのFCY2様遺伝子をクローン化しました。ノーザンブロット分析により、1つの遺伝子のみが発現したことが明らかになりました。FCY2と名付けられました。もう1つは偽遺伝子として振る舞い、FCY21と名付けられました。5FC-FLCへの交差耐性におけるFCY2の可能な役割をよりよく特徴付けるために、C. lusitaniae FCY2遺伝子のUra3遺伝子と統合ベクトルと統合ベクトルを持つ統合ベクトルを伴うaux栄養株6936 Ura3（D95V）FCY2を使用した破壊実験は実施。サザンブロット分析により、居住者遺伝子座FCY2で50％の割合で分析されたすべての形質転換因子で相同組換えイベントが発生し、居住遺伝子座URA3で50％で発生し、遺伝子型URA3 FCY2 :: URA3およびURA3 FCY2をそれぞれ発生させました。その後、破壊されたFCY2遺伝子を抱える形質転換体のみが5FCに耐性があり、FLCの影響を受け、5FC-FLCの組み合わせに耐性があることが実証されました。最後に、機能的なFCY2遺伝子による補完実験により、5FCおよびFLCの感受性が野生型レベルに復元されました。この研究の結果は、唯一のFCY2遺伝子の不活性化がC. lusitaniaeの抗真菌性関連5FC-FLCへの交差耐性を促進するという分子的証拠を提供します。

In a previous work, we described the possible relationship between a defect of purine-cytosine permease and the acquisition of a cross-resistance to the antifungal combination flucytosine (5FC) and fluconazole (FLC) in Candida lusitaniae (T. Noël, F. François, P. Paumard, C. Chastin, D. Brethes, and J. Villard, Antimicrob. Agents Chemother. 47:1275-1284, 2003). Using degenerate PCR and chromosome walking, we cloned two FCY2-like genes in C. lusitaniae. Northern blot analysis revealed that only one gene was expressed; it was named FCY2. The other one behaved as a pseudogene and was named FCY21. In order to better characterize the possible role of FCY2 in cross-resistance to 5FC-FLC, disruption experiments with auxotrophic strain 6936 ura3(D95V) FCY2 with an integrative vector carrying the URA3 gene and a partial sequence of the C. lusitaniae FCY2 gene were undertaken. Southern blot analysis revealed that homologous recombination events occurred in all transformants analyzed at rates of 50% at resident locus FCY2 and 50% at resident locus URA3, resulting in the genotypes ura3 fcy2::URA3 and ura3::URA3 FCY2, respectively. It was then demonstrated that only transformants harboring a disrupted fcy2 gene were resistant to 5FC, susceptible to FLC, and resistant to the 5FC-FLC combination. Finally, complementation experiments with a functional FCY2 gene restored 5FC and FLC susceptibilities to the wild-type levels. The results of this study provide molecular evidence that inactivation of the sole FCY2 gene promotes cross-resistance to the antifungal association 5FC-FLC in C. lusitaniae.