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Kirsten Ras（KRAS）遺伝子の変異は、ほとんどすべての膵臓腺癌に存在し、1つの一般的な突然変異はコドン12にあります：GGT（GLY）はGAT（ASP）に変換されます。この作業では、変異対立遺伝子の発現をダウンレギュレートする目的で、感覚PNA分子（P14）でGAT変異を採用するKRASコーディング配列を標的にしました。P14は、GAT（ASP）変異でKRAのアンチセンス鎖を相補的に相補的に15塩基シーケンスで設計し、核局在化シグナルペプチドPKKKRKVに共役しました。温度の関数としてのCDスペクトルは、P14（2 microM）が、78度CのT（M）を持つ変異対立遺伝子のGATターゲットのアンチセンス鎖と野生のGGTターゲットのGGTターゲットのアンチセンス鎖に結合することを示しています -69度CのT（M）、50 mM Tris-HCl、pH 7.4、および1 M NaClのタイプ対立遺伝子。さらに、p14は、膵臓細胞の核（PANC-1およびBXPC3）に侵入して蓄積する大容量を示しましたが、非結合類似体はそうではありませんでした。定量的RT-PCRは、1ミクロムP14がPANC-1細胞でKRAS転写を特異的に抑制できることを示しました。これは、変異体KRASを抱えていますが、野生型KRAのみを含むBXPC3細胞では抑制できませんでした。ただし、P14は、5および10 microMの濃度で使用すると、BXPC3細胞でもKRAS転写を阻害しました。単一のPNA処理に続いて、タンパク質レベルの変化はPANC-1細胞でのみ明らかでした。RASファミリーの3つの遺伝子すべてが膵臓細胞で発現していることがわかったため、HRAとNRAも標的とするようにPNA-NLSコンジュゲート（P16およびP17）を設計しました。各PNAコンジュゲートのRAS遺伝子への結合は、電気泳動によってアッセイされ、転写を阻害する能力はRT-PCRによって測定されました。in vivoとin vitroの両方で得られたすべてのデータは、PNA-NLS分子とゲノムDNA間の結合の配列特異性の観点から議論されています。
Kirsten Ras（KRAS）遺伝子の変異は、ほとんどすべての膵臓腺癌に存在し、1つの一般的な突然変異はコドン12にあります：GGT（GLY）はGAT（ASP）に変換されます。この作業では、変異対立遺伝子の発現をダウンレギュレートする目的で、感覚PNA分子（P14）でGAT変異を採用するKRASコーディング配列を標的にしました。P14は、GAT（ASP）変異でKRAのアンチセンス鎖を相補的に相補的に15塩基シーケンスで設計し、核局在化シグナルペプチドPKKKRKVに共役しました。温度の関数としてのCDスペクトルは、P14（2 microM）が、78度CのT（M）を持つ変異対立遺伝子のGATターゲットのアンチセンス鎖と野生のGGTターゲットのGGTターゲットのアンチセンス鎖に結合することを示しています -69度CのT（M）、50 mM Tris-HCl、pH 7.4、および1 M NaClのタイプ対立遺伝子。さらに、p14は、膵臓細胞の核（PANC-1およびBXPC3）に侵入して蓄積する大容量を示しましたが、非結合類似体はそうではありませんでした。定量的RT-PCRは、1ミクロムP14がPANC-1細胞でKRAS転写を特異的に抑制できることを示しました。これは、変異体KRASを抱えていますが、野生型KRAのみを含むBXPC3細胞では抑制できませんでした。ただし、P14は、5および10 microMの濃度で使用すると、BXPC3細胞でもKRAS転写を阻害しました。単一のPNA処理に続いて、タンパク質レベルの変化はPANC-1細胞でのみ明らかでした。RASファミリーの3つの遺伝子すべてが膵臓細胞で発現していることがわかったため、HRAとNRAも標的とするようにPNA-NLSコンジュゲート（P16およびP17）を設計しました。各PNAコンジュゲートのRAS遺伝子への結合は、電気泳動によってアッセイされ、転写を阻害する能力はRT-PCRによって測定されました。in vivoとin vitroの両方で得られたすべてのデータは、PNA-NLS分子とゲノムDNA間の結合の配列特異性の観点から議論されています。
Mutations in the Kirsten ras (KRAS) gene are present in almost all pancreatic adenocarcinomas, and one common mutation is at codon 12: GGT (Gly) is transformed into GAT (Asp). In this work we have targeted the KRAS coding sequence embracing the GAT mutation with a sense PNA molecule (P14), with the aim of downregulating the expression of the mutant allele. P14 was designed with a 15-base sequence complementary to the antisense strand of KRAS at the GAT (Asp) mutation and conjugated to the nuclear localization signal peptide PKKKRKV. CD spectra as a function of temperature show that P14 (2 microM) binds to the antisense strand of the GAT target in the mutated allele with a T(M) of 78 degrees C and to the antisense strand of the GGT target in the wild-type allele with a T(M) of 69 degrees C, in 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, and 1 M NaCl. Moreover, P14 showed a high capacity to enter and accumulate in the nuclei of pancreatic cells (Panc-1 and BxPC3), whereas the nonconjugated analogue did not. Quantitative RT-PCR showed that 1 microM P14 was able to specifically suppress KRAS transcription in Panc-1 cells, which harbor mutant KRAS, but not in BxPC3 cells, which contain only wild-type KRAS. However, P14 inhibited KRAS transcription also in BxPC3 cells when used at concentrations of 5 and 10 microM. Following a single PNA treatment, changes in protein level were evident only in Panc-1 cells. As we found that all three genes of the ras family are expressed in the pancreatic cells, we designed PNA-NLS conjugates (P16 and P17) to target also HRAS and NRAS. The binding of each PNA conjugate to the ras genes was assayed by electrophoresis, and their capacity to inhibit transcription was measured by RT-PCR. All of the data obtained, both in vivo and in vitro, are discussed in terms of sequence specificity in the binding between PNA-NLS molecules and genomic DNA.
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