小胞口口​​炎ウイルスの形成偽型肝炎ウイルスの表面タンパク質

組織培養でB型肝炎ウイルス（HBV）を伝播して滴定することは困難でした。我々は、人間の細胞株に感染するHBV表面（HBS）タンパク質を持つ小胞口口炎ウイルス（VSV）偽型を調製するかどうかを調べました。このために、HBVの3つの表面タンパク質L、M、およびSの発現プラスミドを作成しました。次に、293T細胞にこれらのプラスミドを個別にまたは異なる組み合わせでトランスフェクトしました。HBSタンパク質を発現する293T細胞に、VSVDELTAG*-G、緑色蛍光タンパク質（GFP）を発現する組換えVSVに感染して、VSV偽型を作成しました。細胞と一緒に培養上清を収穫し、短時間超音波処理しました。採取されたばかりの上清の感染性は、HBSタンパク質に対する抗VSV血清およびマウスモノクローナル抗体（mAb）による中和後にGFPを発現する細胞の数を定量化することにより決定されました。HBV偽型サンプルに対する感受性についてテストされた14の細胞株のうち、HEPG2、JHH-7、および293T細胞が最も感受性があると判断されました。すなわち、抗HBS mabの非存在下および存在下で抗VSVで中和され、HepG2細胞上で滴定された抗VSVで中和された培養上清サンプルの感染性ユニット（IU）は、1,000〜4,000 IU/mLおよび200〜400 IU/mLの範囲でした。それぞれ、vsvdeltag*（HBV）偽型の存在を示唆しています。この感染性は、ラクトフェリンまたはデキストラン硫酸による治療により阻害されました。トリプシンまたはチュニカマイシンによる細胞の前処理は、偽型サンプルのメッキを阻害しました。HBV偽型を使用して、HBVの侵入メカニズムを含むHBV感染の初期段階を分析することができます。

It has been difficult to propagate and titrate hepatitis B virus (HBV) in tissue culture. We examined whether vesicular stomatitis virus (VSV) pseudotypes bearing HBV surface (HBs) proteins infectious for human cell lines could be prepared. For this, expression plasmids for three surface proteins, L, M, and S, of HBV were made. 293T cells were then transfected with these plasmids either individually or in different combinations. 293T cells expressing HBs proteins were infected with VSVdeltaG*-G, a recombinant VSV expressing green fluorescent protein (GFP), to make VSV pseudotypes. Culture supernatants together with cells were harvested and sonicated for a short time. The infectivities of freshly harvested supernatants were determined by quantifying the number of cells expressing GFP after neutralization with anti-VSV serum and mouse monoclonal antibodies (MAbs) against HBs protein. Among 14 cell lines tested for susceptibility to HBV pseudotype samples, HepG2, JHH-7, and 293T cells were judged to be the most susceptible. Namely, the infectious units (IU) of the culture supernatant samples neutralized with anti-VSV in the absence and presence of anti-HBs S MAbs and titrated on HepG2 cells ranged from 1,000 to 4,000 IU/ml and 200 to 400 IU/ml, respectively, suggesting the presence of VSVdeltaG*(HBV) pseudotypes. This infectivity was inhibited by treatment with lactoferrin or dextran sulfate. Pretreatment of the cells with trypsin or tunicamycin inhibited plating of the pseudotype samples. The HBV pseudotypes can be used to analyze early steps of HBV infection, including the entry mechanism of HBV.