カルモジュリン拮抗薬の識別のために蛍光共鳴エネルギー移動を使用した競合結合アッセイ

タンパク質カルモジュリン（CAM）を調節するユビキタスカルシウムは、薬理学的スクリーニングのための競合結合蛍光共鳴エネルギー伝達アッセイの設計においてモデル薬物標的として利用されています。タンパク質は、チオール反応性フルオロフォア、n- [2-（1-マレイミジル）エチル] -7-（ジエチルアミノ）クマリン-3-カルボンコミド（MDCC）をエンジニアリングC末端システイン残基に共有結合することにより標識されました。環境に敏感な疎水性プローブ2,6-アニリノナフタレンスルホン酸（2,6-ANS）のカムへの結合は、2,6-ANの蛍光放射強度の増加によって監視できます。2,6-AN（ドナーとして機能する）からMDCC（このシステムのアクセプター）への蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）の証拠も観察されました。MDCCの蛍光発光は、2,6-ANに特異的な波長でサンプルが励起された後に見ることができました。FRET信号は、溶液中のカルモジュリン拮抗薬の濃度の関数として監視されました。このシステムを使用して、既知のカム結合ドメインに基づく一連の小分子と一連のペプチドの両方のキャリブレーション曲線が取得されました。このアッセイは、CAMの生物学的活性を妨げることが知られている分析物による用量依存性拮抗作用を示した。これらのデータは、CAMが発生するFRETの能力を妨げることが知られている分子の存在が発生することを示しているため、受容体の比：ドナー蛍光放出の濃度依存性の減少につながることを示しています。このアッセイは、優先結合活性を持つ分子のスクリーニングを目的とした他のタンパク質結合アッセイの開発の一般的なモデルとして機能します。

The ubiquitous calcium regulating protein calmodulin (CaM) has been utilized as a model drug target in the design of a competitive binding fluorescence resonance energy transfer assay for pharmacological screening. The protein was labeled by covalently attaching the thiol-reactive fluorophore, N-[2-(1-maleimidyl)ethyl]-7-(diethylamino)coumarin-3-carboxamide (MDCC) to an engineered C-terminal cysteine residue. Binding of the environmentally sensitive hydrophobic probe 2,6-anilinonaphthalene sulfonate (2,6-ANS) to CaM could be monitored by an increase in the fluorescence emission intensity of the 2,6-ANS. Evidence of fluorescence resonance energy transfer (FRET) from 2,6-ANS (acting as a donor) to MDCC (the acceptor in this system) was also observed; fluorescence emission representative of MDCC could be seen after samples were excited at a wavelength specific for 2,6-ANS. The FRET signal was monitored as a function of the concentration of calmodulin antagonists in solution. Calibration curves for both a selection of small molecules and a series of peptides based upon known CaM-binding domains were obtained using this system. The assay demonstrated dose-dependent antagonism by analytes known to hinder the biological activity of CaM. These data indicate that the presence of molecules known to bind CaM interfere with the ability of FRET to occur, thus leading to a concentration-dependent decrease of the ratio of acceptor:donor fluorescence emission. This assay can serve as a general model for the development of other protein binding assays intended to screen for molecules with preferred binding activity.