細菌のプラスミドコピー数を測定するための定量的リアルタイムポリメラーゼ連鎖反応

リアルタイムの定量的ポリメラーゼ連鎖反応（QPCR）による細菌におけるプラスミドコピー数（PCN）の測定方法は、現在のPCNアッセイの代替として開発されました。PCN推定のための従来の方法は、一般に高度なスループットではなく、面倒で、再現性が低く、大量の生物学的サンプルが必要であり、狭いダイナミックレンジにのみ適用できます。ABI Prism 7000を使用したリアルタイムQPCRは、PUC ORIベースのプラスミドNS3の量を敏感に検出することができ、大腸菌の宿主であるDH5alphaに変換され、411 +/- 6.1になりました。DH5ALPHAのPBR322プラスミドDNAのPCNは、以前に報告されたPCN範囲約30〜70の40 +/- 0.6と推定されました。QPCRは、テンプレート濃度の2倍差を検出する際に良好な再現性と高感度を示すことがわかりました。、および0.5 pgから50 ngのDNAをカバーする広い線形動的範囲。リアルタイムQPCRアッセイから計算されたプラスミドPBR322およびNS3のPCNは、アガロースゲルアッセイのそれによって検証され、2つのプラスミドでそれぞれ13.0％と10.7％のわずかな差が見つかりました。QPCRアッセイは、2 Lバッチ発酵中にDH5alphaを産生するプラスミドのPCNの変化を検出することができました。

A method for determination of plasmid copy number (PCN) in bacteria by real-time quantitative polymerase chain reaction (QPCR) was developed as an alternative to current PCN assays. Conventional methods for PCN estimation are generally not of high throughput, laborious, have low reproducibility, require large amounts of biological samples and are applicable only for a narrow dynamic range. Real-time QPCR, using the ABI Prism 7000, was able to sensitively detect the quantity of the pUC ori based plasmid, NS3, transformed into Escherichia coli host, DH5alpha, to be 411+/-6.1. The PCN of pBR322 plasmid DNA in DH5alpha was estimated to be 40+/-0.6 which is within its previously reported PCN range of approximately 30 to 70. QPCR was found to show good reproducibility and high sensitivity in detecting a two fold difference in template concentration, and a wide linear dynamic range covering 0.5 pg to 50 ng of DNA. PCNs of DH5alpha bearing plasmids pBR322 and NS3 computed from real-time QPCR assay were validated by that of agarose gel assay, and a marginal difference of only 13.0% and 10.7% was found for the two plasmids respectively. The QPCR assay was able to detect changes in PCN of plasmid producing DH5alpha during the course of a 2 l batch fermentation.