タンデム親和性浄化による感染細胞からのウイルス性リボ核タンパク質複合体の分離

負の鎖RNAウイルスのウイルスリボ核タンパク質複合体（RNP）の生化学的精製と分析は、これらの複合体の特定の濃縮を促進する適切なタグの欠如によって妨げられます。したがって、核タンパク質であるウイルスRNPの主成分にタンデムアフィニティ浄化（TAP）タグの融合が、細胞からこれらのRNPの分離を可能にする可能性があるかどうかをテストしました。このウイルスに感染した細胞で、ボルダ疾患ウイルス（BDV）のタップタグ付き核タンパク質を構成的に発現しました。タップタグ付きの餌は、ウイルスRNPに効率的に組み込まれ、BDV複製を妨害せず、ウイルス粒子にもパッケージ化されました。2つの連続した親和性カラムによるBDV感染細胞からのタグ付きタンパク質複合体のネイティブ精製により、MS分析によって核タンパク質の2つの形態であるMS分析によって同定されたいくつかのウイルスタンパク質が分離されました。ウイルスタンパク質に加えて、RT-PCR分析により、ウイルスゲノムRNAの存在が明らかになりました。タップタグ内のさらなるプロテアーゼ切断部位の導入により、精製収量が大幅に増加しました。これらの結果は、タップタグ付きウイルスRNPの精製が可能で効率的であり、したがってこれらの複合体の生化学的および機能的研究の新しい手段を提供する可能性があることを示しています。

The biochemical purification and analysis of viral ribonucleoprotein complexes (RNPs) of negative-strand RNA viruses is hampered by the lack of suitable tags that facilitate specific enrichment of these complexes. We therefore tested whether fusion of the tandem-affinity-purification (TAP) tag to the main component of viral RNPs, the nucleoprotein, might allow the isolation of these RNPs from cells. We constitutively expressed TAP-tagged nucleoprotein of Borna disease virus (BDV) in cells persistently infected with this virus. The TAP-tagged bait was efficiently incorporated into viral RNPs, did not interfere with BDV replication and was also packaged into viral particles. Native purification of the tagged protein complexes from BDV-infected cells by two consecutive affinity columns resulted in the isolation of several viral proteins, which were identified by MS analysis as the matrix protein, the two forms of the nucleoprotein and the phosphoprotein. In addition to the viral proteins, RT-PCR analysis revealed the presence of viral genomic RNA. Introduction of further protease cleavage sites within the TAP-tag significantly increased the purification yield. These results demonstrate that purification of TAP-tagged viral RNPs is possible and efficient, and may therefore provide new avenues for biochemical and functional studies of these complexes.