クリアネイティブページの利点と制限

クリアネイティブページ（CN-PAGE）は、アクリルアミド勾配ゲルで酸性水溶性と膜タンパク質（PI <7）を分離し、通常、青ナティブページ（BN-PAGE）よりも分解能が低くなります。移動距離は、タンパク質固有の電荷と、勾配ゲルの孔サイズに依存します。これは、ネイティブ質量とオリゴマー化状態の推定を複雑にし、BN-PAGEと比較して、タンパク質に負に帯電したタンパク質結合クーマシー染料を使用してタンパク質に電荷シフトを課します。したがって、CN-PAGEではなくBN-PAGEが標準分析に一般的に使用されます。ただし、CN-PAGEは、ミトコンドリアATPシンターゼのためにここで示されているように、触媒活性の測定、または蛍光共鳴エネルギー伝達のための膜タンパク質複合体の効率的なマイクロスケール分離など、触媒活性の測定、つまり触媒活性の測定をさらに分析するために必要な技術をクーマシー染色が干渉する場合はいつでも利点を提供します。（FRET）分析。CN-PAGEはBN-PAGEよりも穏やかです。特に、ジギトニンとCN-PAGEの組み合わせは、BN-PAGEの条件下で解離する膜タンパク質複合体の不安定な超分子集合体を保持できます。BN-PAGEを使用して以前に検出されていなかったミトコンドリアATPシンターゼの酵素的に活性なオリゴマー状態は、CN-PAGEによって同定されました。

Clear-native PAGE (CN-PAGE) separates acidic water-soluble and membrane proteins (pI < 7) in an acrylamide gradient gel, and usually has lower resolution than blue-native PAGE (BN-PAGE). The migration distance depends on the protein intrinsic charge, and on the pore size of the gradient gel. This complicates estimation of native masses and oligomerization states when compared to BN-PAGE, which uses negatively charged protein-bound Coomassie-dye to impose a charge shift on the proteins. Therefore, BN-PAGE rather than CN-PAGE is commonly used for standard analyses. However, CN-PAGE offers advantages whenever Coomassie-dye interferes with techniques required to further analyze the native complexes, e.g., determination of catalytic activities, as shown here for mitochondrial ATP synthase, or efficient microscale separation of membrane protein complexes for fluorescence resonance energy transfer (FRET) analyses. CN-PAGE is milder than BN-PAGE. Especially the combination of digitonin and CN-PAGE can retain labile supramolecular assemblies of membrane protein complexes that are dissociated under the conditions of BN-PAGE. Enzymatically active oligomeric states of mitochondrial ATP synthase previously not detected using BN-PAGE were identified by CN-PAGE.