PCRベースの調査のためのチーズからのリボソームRNAおよびゲノムDNAの新規抽出戦略

細菌や真菌などのチーズ微生物は、チーズの熟成において中心的な役割を果たす複雑な生態系を構成します。チーズ微生物の多様性と活性の分子研究は不可欠ですが、高品質の核酸の抽出には問題があるかもしれません。チーズサンプルは、抽出されたrRNAの収量に悪影響を与える強力な緩衝能力によって特徴付けられます。この研究の目的は、同じチーズサンプルからの酵母と細菌のリボソームRNAおよびゲノムDNAの直接的および同時分離のための効果的な方法を開発することです。DNA分離は、カオトロピック剤（チオシアネート酸グアニジニウムチオシアン）、洗剤（SDS、N-ローイルサルコシン）、キレート剤（EDTA）の作用の組み合わせた使用との予備的な洗浄ステップなしで、嫌気性消化器からの核酸分離に使用されるプロトコルに基づいていました。および機械的方法（ビーズ鼓動システム）。DNA精製は、フェノールクロロホルムの2つの洗浄ステップによって実行されました。RNAは、最初の酸抽出のフェノール相から回収することにより、2回目の酸抽出ステップの後に正常に分離されました。新規方法により、逆転写PCRにアクセス可能な未分裂RNAの純粋な調製が得られました。ゲノムDNAとRRNAの抽出プロトコルは、異なるチーズマトリックスの複雑な生態系に適用できました。

Cheese microorganisms, such as bacteria and fungi, constitute a complex ecosystem that plays a central role in cheeses ripening. The molecular study of cheese microbial diversity and activity is essential but the extraction of high quality nucleic acid may be problematic: the cheese samples are characterised by a strong buffering capacity which negatively influenced the yield of the extracted rRNA. The objective of this study is to develop an effective method for the direct and simultaneous isolation of yeast and bacterial ribosomal RNA and genomic DNA from the same cheese samples. DNA isolation was based on a protocol used for nucleic acids isolation from anaerobic digestor, without preliminary washing step with the combined use of the action of chaotropic agent (acid guanidinium thiocyanate), detergents (SDS, N-lauroylsarcosine), chelating agent (EDTA) and a mechanical method (bead beating system). The DNA purification was carried out by two washing steps of phenol-chloroform. RNA was isolated successfully after the second acid extraction step by recovering it from the phenolic phase of the first acid extraction. The novel method yielded pure preparation of undegraded RNA accessible for reverse transcription-PCR. The extraction protocol of genomic DNA and rRNA was applicable to complex ecosystem of different cheese matrices.