GFPベースのFRETプローブを使用したRasおよびRho GTPaseの時空間的調節の監視

これらのタンパク質の時空間的調節を調べるために、生細胞のRasおよびRho GTPaseの局所的な活動変化を視覚化するGFPベースの蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）プローブが利用可能になりました。この記事では、RASおよびRho-Family GTPaseの分子内FRETプローブを開発するための原則と戦略について説明します。候補プローブを特徴付ける手順、および画像の獲得と処理についても説明します。最適なFRETプローブには、（i）広いダイナミックレンジ（高い感度を意味します）、（ii）高い蛍光強度、（iii）ターゲットの特異性、および（iv）内因性シグナル伝達カスケードへの最小限の摂動があります。FRETプローブの改善は試行錯誤の方法で実行される必要がありますが、最適化のための実用的なヒントがここで提供されます。さらに、さまざまな機能を持つ多様な細胞内コンパートメントで構成されるニューロン細胞のFRETプローブのいくつかの用途を示します。したがって、各コンパートメントのGTPaseアクティビティのダイナミクスを解読するためのツールは長い間望まれています。

GFP-based fluorescence resonance energy transfer (FRET) probes that visualize local activity-changes of Ras and Rho GTPases in living cells are now available for examining the spatio-temporal regulation of these proteins. This article describes principles and strategies to develop intramolecular FRET probes for Ras- and Rho-family GTPases. The procedure for characterizing candidate probes, and image acquisition and processing are also explained. An optimal FRET probe should have (i) a wide dynamic range (which means a high sensitivity), (ii) a high fluorescence intensity, (iii) target specificity, and (iv) a minimal perturbation to endogenous signaling cascades. Although an improvement of FRET probes should be executed in a trial-and-error manner, practical tips for optimization are provided here. In addition, we illustrate some applications of FRET probes for neuronal cells, which are composed of diverse subcellular compartments with different functions; thus, tools to decipher the dynamics of GTPase activity in each compartment have long been desired.